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纳米纤维（NF）左旋聚乳酸（PLLA）支架材料在牙本质牙髓组织工程中的应用研究

作　者: 王静
导　师: 倪龙兴；Peter X Ma
学　校: 第四军医大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 纳米左旋聚乳酸人牙髓干细胞牙本质牙髓组织工程纳米羟基磷灰石骨形成蛋白－7
分类号: R318.08
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

龋病、牙髓病是人类口腔最常见的疾病。目前的治疗方法主要是祛除病变组织后,利用银汞、树脂、牙胶等合成的材料修复病变组织。然而,此类材料并不能完全替代牙本质牙髓组织的功能,往往造成牙齿的机械性能和活性降低;长此以往,患者的咀嚼与消化功能也会受到影响。组织工程技术的出现为牙本质牙髓组织修复提供了新的契机。与构建其它组织相类似,牙本质牙髓组织工程也应具备三要素;即种子细胞、生长因子和支架材料。支架材料在组织工程再生中起着关键的作用,理想的支架材料应该能够模拟天然的细胞外基质(ECM)成分。胶原是多种细胞的天然ECM成分,也是牙齿硬组织形成的钙化中心和牙髓基质的主要组成成分。作为支架材料也已广泛用于牙组织工程研究。然而,天然胶原材料具有机械性能较差,同时还有可能造成交叉感染、免疫反应等缺点。我们应用相分离技术构建出具有多孔结构和良好机械性能的纳米(NF)左旋聚乳酸(PLLA)支架材料。该材料模拟ColI结构,具有与其相似的纳米纤维尺寸(50-500nm）。在本研究中我们将人牙髓干细胞（DPSCs）接种于NF-PLLA支架材料上；此外，我们还通过联合应用骨形成蛋白- 7（BMP-7）和的赛米松（DXM）诱导因子，以及通过对材料进行纳米羟基磷灰石（nHA）修饰等方法诱导DPSCs在支架材料上向成牙本质细胞分化和矿化。由于牙本质和牙髓组织结构和功能的特异性，我们还通过选用不同支架材料和生长因子，采用分离培养的方法，构建出了具有一定组织结构和形态大小的牙本质牙髓样组织。所取得的研究成果如下：1.NF-PLLA支架材料促进人DPSCs向成牙本质样细胞分化和矿化的实验研究本部分的研究目是调查，跟传统的PLLA材料相比，NF-PLLA支架材料是否更有利于人DPSCs向成牙本质样细胞分化和矿化。体外结果显示：跟传统PLLA材料相比，纳米PLLA支架更有利于人DPSCs的粘附、增殖和向成牙本质细胞分化。在纳米支架材料上，ALP活性和向成牙本质细胞分化的相关基因（Col I，OCN和DSPP）的表达均明显上调。此外，Von Kossa染色、钙含量测定以及SEM的结果显示，在NF-PLLA材料上生成的矿化产物明显多于在普通材料（SW-PLLA）上生成的量。与体外结果相一致，将细胞材料复合体移植于裸鼠皮下8周后，Von Kossa染色, Masson’s三色法染色和抗DSP免疫组化染色结果均证实，NF-PLLA支架材料能更好的促进人DPSCs向成牙本质细胞分化和硬组织形成。以上结果充分说明，NFPLLA支架材料在体内与体外均能促进成牙本质分化和矿化组织形成，在牙组织工程领域有着广阔的应用前景。2.BMP-7与DXM联合应用促进人DPSCs在NF-PLLA支架材料上向成牙本质样细胞分化和矿化的实验研究第一部分的研究已证实，跟SW-PLLA材料相比，NF-PLLA材料更有利于人DPSCs向成牙本质细胞分化和硬组织形成。在本部分的研究中，我们选取NF-PLLA作为支架材料，观察BMP-7与DXM联合应用对人DPSCs向成牙本质样细胞分化和矿化的影响。我们将人DPSCs接种于支架材料上，并在不同诱导条件下进行培养，分组情况如下：“对照组”不加矿化诱导剂；“DXM”组含有10-8 M DXM, 50 ?g/mL抗坏血酸和5 mMβ-磷酸甘油钠；“BMP-7+DXM”组含有10-8 M DXM, 50 ?g/mL抗坏血酸，5 mMβ-磷酸甘油钠以及50 ng/mL BMP-7。ALP活性测定、RT-PCR、SEM、vonKossa染色和钙含量测定等方法用于体外成牙本质分化研究。结果显示，“DXM”组和“BMP-7+DXM”组均可诱导人DPSCs向成牙本质细胞分化，并且联合应用组的诱导效果更强。体内实验结果进一步证实，将细胞材料复合体移植于裸鼠皮下8周后，跟DXM组相比较，联合应用组形成更多细胞外基质和矿化组织。抗DSP免疫组化阳性结果进一步证实了人DPSCs向成牙本质细胞分化。综上所述，跟单独应用DXM相比较，将其与BMP-7联合应用，更有利于成牙本质细胞分化和矿化。NF-PLLA支架材料与上述成牙本质分化诱导因子相结合，为牙本质再生提供了良好的条件。3.NF-PLLA/nHA支架材料促进人DPSCs向成牙本质细胞分化和矿化的实验研究在部分的研究中，我们采用电泳沉积的方法对NF-PLLA支架材料进行nHA修饰。同未经修饰的NF-PLLA材料相比，NF-PLLA/nHA支架材料能够更好的促进矿化组织形成。DNA含量、ALP活性和骨钙素测定结果显示：两种材料均可促进人DPSCs的粘附、增殖；并且NF-PLLA/ nHA材料能够明显上调DNA含量和ALP活性，促进骨钙素的表达。综上所述，以上结果证实了nHA修饰的NF-PLLA材料结合可促进生物矿化，可用于牙本质组织再生修复。4.利用NF-PLLA/nHA和海藻酸钙水凝胶支架材料构建组织工程化牙本质牙髓组织的实验研究虽然牙髓与牙本质组织均由牙乳头细胞发育而来，两者在结构和功能上仍存在着显著的诧异。在本部分的研究中，我们分别选用NF-PLLA /nHA和海藻酸钙水凝胶两种支架材料在体内构建组织工程化的牙本质和牙髓组织。为了模拟天然牙本质牙髓组织结构横断面结构，我们将支架材料制备成园盘状，由内外两部份组成。外部为NF-PLLA /nHA材料，用于构建牙本质；内部由海藻酸钙水凝胶材料组成，用于构建牙髓样组织。同时，不同部分选用不同的生长因子（外部：BMP-7与DXM联合应用：内部：bFGF）。研究结果显示：将细胞材料复合体移植于裸鼠皮下8周后，可形成牙本质和牙髓样结构。在外部NF-PLLA / nHA材料上可观察到大量的细胞、胶原和矿化组织；抗DSP抗体免疫组织化学（IHC）阳性染色结果证实了人DPSCs向成牙本质细胞分化。在中央部的海藻酸钙水凝胶材料上，H.E和Masson’s三色法染色结果证实，有大量软组织样组织形成和大量血管长入。与外部材料结果不同的是，中央部材料上没有矿化组织形成，抗DSP抗体IHC染色亦为阴性。综上所述，选用NF-PLLA /nHA和海藻酸钙水凝胶材料，并利用BMP-7+DXM和bFGF进行诱导，为牙本质牙髓组织再生研究提供了新的研究思路和方法。

全文目录

缩略语表  6-8
中文摘要  8-12
英文摘要  12-17
前言与文献回顾  17-38
  一、牙体牙髓组织工程的研究进展  18-31
  二、纳米仿生组织工程支架材料的研究进展  31-38
正文  38-104
  第一部分利用NF-PLLA支架材料促进人DPSCs向成牙本质细胞分化和矿化的实验研究  38-65
    实验一 NF-PLLA 支架材料的制备及其与人DPSCs 相容性的实验研究  40-49
      1 材料与方法  40-43
      2 结果  43-47
      3 讨论  47-49
    实验二人DPSCs 在NF-PLLA 支架材料上向成牙本质细胞分化及矿化的体外实验研究  49-60
      1 材料与方法  49-53
      2 结果  53-58
      3 讨论  58-60
    实验三人DPSCs 在NF-PLLA 支架材料上向成牙本质细胞分化及矿化的体内实验研究  60-65
      1 材料与方法  60-61
      2 结果  61-63
      3 讨论  63-65
  第二部分 BMP-7 和DXM 联合应用促进人DPSCs 在NF-PLLA 支架上向成牙本质细胞分化和矿化的实验研究  65-83
    实验一 BMP-7 对人DPSCs 增殖和ALP 活性的影响  67-71
      1 材料和方法  67-68
      2 结果  68-69
      3 讨论  69-71
    实验二 BMP-7 和DXM 联合应用促进人DPSCs 向成牙本质细胞分化和矿化的体外实验研究  71-79
      1 材料和方法  71-73
      2 结果  73-77
      3 讨论  77-79
    实验三 BMP-7 和DXM 联合应用促进人DPSCs 向成牙本质细胞分化和矿化的体内实验研究  79-83
      1 材料和方法  79
      2 结果  79-81
      4 讨论  81-83
  第三部分纳米羟基磷灰石（nHA）修饰的NF-PLLA 支架材料体外矿化的实验研究  83-94
    实验一 NF-PLLA/nHA 支架材料的制备及其与人DPSCs 相容性的实验研究  84-90
      1 材料与方法  84-85
      2 结果  85-87
      3 讨论  87-90
    实验二 NF-PLLA/ nHA 材料促进矿化的体外实验研究  90-94
      1 材料与方法  90-91
      2 结果  91-93
      3 讨论  93-94
  第四部分利用不同支架材料和诱导因子构建组织工程化的牙本质和牙髓组织的实验研究  94-104
    实验一构建牙本质牙髓组织的支架材料及诱导因子的选择  94-100
      1 材料与方法  95-96
      2 结果  96-98
      3 讨论  98-100
    实验二利用不同支架材料和诱导因子构建牙本质牙髓组织的体内实验研究  100-104
      1 材料与方法  100
      2 结果  100-103
      3 讨论  103-104
全文总结  104-105
参考文献  105-120
个人简历和研究成果  120-123
致谢  123

纳米纤维（NF）左旋聚乳酸（PLLA）支架材料在牙本质牙髓组织工程中的应用研究

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