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提高牙髓干细胞牙向分化潜能的研究

作　者: 王放放
导　师: 张彦定
学　校: 福建师范大学
专　业: 发育生物学
关键词: 牙髓干细胞 牙齿发育 牙向分化 慢病毒 牙齿再生
分类号: R78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 42次
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内容摘要


牙齿再生是采用人体的组织或细胞,在体外再生出具有正常形态,大小及生物功能的牙齿来取代传统方法用于修复受损牙齿的目的。本篇论文主要采用慢病毒介导技术对提高人牙髓干细胞的牙向分化的潜能进行研究,找出一种在牙髓干细胞牙向分化过程中起重要作用的关键因子,提高牙髓干细胞牙向分化的能力,为牙齿再生的组织工程研究提供种子细胞与方法依据。在本篇论文的研究工作中,我们分离和培养了成人的牙髓干细胞,先后克隆了三种在牙齿发育过程中起重要作用的因子于慢病毒载体上,大量生产并浓缩出高滴度的病毒颗粒对牙髓干细胞进行分组诱导,为后期研究牙髓干细胞牙向分化潜能的工作奠定基础。通过一系列的检测,我们发现:同感染空载病毒相比较,感染携带有目的基因的牙髓干细胞能够表达牙本质细胞特异蛋白DSPP,而过表达了基因MSX1的牙髓干细胞比过表达PAX9和BMP4的牙髓干细胞分泌出更多的DSP,osteocalcin,osteopontin等牙齿结构特异性蛋白;同时被携带有MSX1慢病毒感染的牙髓干细胞碱性磷酸酶活性最高;钙化程度也最高。这表明牙髓干细胞具有在体外被诱导为牙本质细胞的潜能,同时基因MSX1是牙髓干细胞牙向分化过程中的关键因子,过表达基因MSX1对于提高牙髓干细胞牙向分化的能力起到显著作用。

全文目录


摘要  2-3
Abstract  3-4
中文文摘  4-9
绪论  9-19
第一章 材料与方法  19-35
  1.1 材料  19-23
    1.1.1 菌株和载体  19
    1.1.2 细胞  19
    1.1.3 实验仪器与设备  19
    1.1.4 主要试剂和器皿  19-21
    1.1.5 试剂配方  21-23
    1.1.6 RT-PCR引物  23
  1.2 方法  23-35
    1.2.1 携带有目的基因的慢病毒载体的制备  23-26
    1.2.2 慢病毒的生产  26-30
      1.2.2.1 大量提取慢病毒包装质粒  26-27
      1.2.2.2 293T细胞的扩培与冻存  27-28
      1.2.2.3 磷酸钙法转染293T细胞,大量生产慢病毒  28-29
      1.2.2.4 慢病毒液的收集与浓缩  29
      1.2.2.5 测定病毒滴度  29
      1.2.2.6 最佳MOI的确定  29-30
    1.2.3 牙髓干细胞的培养及感染  30-31
    1.2.4 被感染后牙髓干细胞的鉴定  31-35
      1.2.4.1 RT-PCR  31-32
      1.2.4.2 测定碱性磷酸酶活性  32-33
      1.2.4.3 HE染色  33
      1.2.4.4 免疫组化  33
      1.2.4.5 茜素红染色测钙化  33-35
第二章 实验结果  35-49
  2.1 牙髓干细胞的体外分离和培养  35
  2.2 构建携带目的基因的慢病毒载体的鉴定  35-40
    2.2.1 慢病毒生产后的鉴定  36-38
    2.2.2 慢病毒滴度的测定  38-39
    2.2.3 最佳感染复数的确定  39-40
  2.3 过表达后牙髓干细胞组织形态的变化  40-41
  2.4 过表达后牙髓干细胞牙向分化的检测  41-49
    2.4.1 RT-PCR检测过表达后的牙髓干细胞能够表达DSPP  41-42
    2.4.2 过表达的牙髓干细胞能够提高碱性磷酸酶活性  42-44
    2.4.3 过表达的牙髓干细胞能够分泌牙本质细胞特异性蛋白  44-47
    2.4.4 茜素红检测钙化程度  47-49
第三章 分析与讨论  49-53
  3.1 过表达基因BMP4、MSX1和PAX9的选择  49-50
  3.2 影响慢病毒转染效率的因素及MOI的确定  50
  3.3 牙髓干细胞牙向分化的检测  50-53
第四章 结论  53-55
  4.1 成功构建分别携带三种目的基因的慢病毒载体  53
  4.2 生产出具有高滴度的三种病毒并确定最佳感染复数  53
  4.3 过表达的牙髓干细胞能够向牙齿方向分化  53
  4.4 基因MSX1能够增强牙髓干细胞牙向分化的能力  53-55
附录1 质粒图谱  55-57
附录2 测序报告单  57-63
附录3 英文缩略语表  63-65
参考文献  65-73
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  73-75
致谢  75-77
个人简历  77

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中图分类: > 医药、卫生 > 口腔科学
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