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弓形虫代谢分泌抗原和表面蛋白1抗原表位研究

作　者: 王艳华
导　师: 殷宏；张德林
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 弓形虫 代谢分泌抗原 表面蛋白1 多表位肽 免疫保护 线性B细胞表位鉴定
分类号: R392
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫,具有广泛的宿主群并在世界范围内流行,引起人兽共患寄生虫病。在畜牧业方面,怀孕动物尤其是牛和羊会出现流产或死胎,猪会大批死亡,给畜牧业造成巨大经济损失。因此建立特异、快速、灵敏的弓形虫病诊断方法和研制有效预防弓形虫病的疫苗成为迫切需要解决的问题。由于弓形虫抗原成分较复杂,实验表明,单一抗原疫苗免疫效果或诊断试剂检测效果均不理想,研制多表位疫苗和诊断试剂必然是一个新的发展策略。本研究在弓形虫代谢分泌抗原和多表位抗原免疫保护研究基础之上,对主要抗原的线性B细胞表位进行了鉴定,为制备弓形虫B细胞表位抗原奠定基础。主要研究结果如下：1)代谢分泌抗原(ESA)较其它可溶性抗原和包囊抗原能更好的诱导细胞免疫反应,是研制抗弓形虫疫苗的一种非常好的候选抗原。本研究评估了ESA与弗氏佐剂乳化疫苗对猪的免疫保护效果,通过对细胞免疫和体液免疫水平、血液中荷虫量、猪临床症状、病理剖解及组织变化等一些重要参数的评估,表明ESA加弗氏佐剂乳化疫苗诱导猪产生的细胞和体液免疫反应能抵抗急性弓形虫感染。2)本研究中,我们首次探讨一个线性B细胞表位(来自表面蛋白1(SAG1)保守区域)和两个T细胞表位(来自致密颗粒蛋白1(GRA1)和致密颗粒蛋白4(GRA4))通过GG间隔序列串联,然后连接到赖氨酸以多表位肽(MAP)形式免疫小鼠所引发的免疫反应。结果,MAP结构+弗氏佐剂不仅诱导BALB/c和昆明小鼠产生高水平特异性抗体,而且还诱导小鼠发生强烈的细胞免疫反应,用致死剂量的弓形虫GJS强毒株(1×103)攻击免疫鼠,小鼠的存活时间比对照组的明显延长。数据证明多表位肽疫苗可作为一种弓形虫候选疫苗值得进一步进行研究。3)本研究利用B细胞表位分析软件预测和肽扫描技术两种方法对弓形虫两个主要抗原SAG1和GRA1的优势线性B细胞表位进行筛选。对于SAG1鉴定到2个新的高度保守的线性B细胞抗原表位91PTLAYSPNRQICPAGTTSSCTSKAVTLSSL120和151PVTTQTFVVGCIKGDDAQSCMVTVTVQARA180;对于GRA1鉴定了3个新的高度保守的线性B细胞抗原表位134 YSEVGNVNMEEVIDTMKSMQ153、164NKGETVEEAIEDVAQAEGLN183和214LEKDKQQLKDDIGFLTGERE233),所鉴定到的表位与弓形虫感染猪血清反应原性良好,有研发诊断试剂和表位疫苗的价值。4)本研究以91PTLAYSPNRQICPAGTTSSCTSKAVTLSSL120和164NKGETVEEAIEDVAQAEGLN183两条合成肽作为抗原建立了一种检测猪弓形虫抗体的肽ELISA(Pep-ELISA)方法。敏感性和特异性分别为88.06%和97.87%。Pep-ELISA敏感性或许可通过增加其它抗原表位(源于同种蛋白或其他蛋白)得到进一步提高,因此基于合成肽ELISA可能会成为弓形虫病诊断的重要工具之一。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-14
第一章 文献综述  14-28
  1.1 弓形虫疫苗研究进展  14-15
    1.1.1 全虫疫苗  14
    1.1.2 基因工程疫苗  14
    1.1.3 核酸疫苗  14-15
  1.2 弓形虫病的诊断方法研究进展  15-16
    1.2.1 病原学诊断方法  15
    1.2.2 免疫学诊断方法  15-16
    1.2.3 分子生物学方法  16
  1.3 弓形虫主要抗原  16-21
    1.3.1 SAG  17
    1.3.2 ESA  17-21
  1.4 弓形虫表位研究  21-26
    1.4.1 B细胞抗原表位研究  21-23
    1.4.2 T细胞表位研究  23-24
    1.4.3 表位疫苗设计原理  24
    1.4.4 表位肽疫苗的载体  24-25
    1.4.5 弓形虫抗原表位应用研究  25-26
    1.4.6 表位疫苗优缺点  26
  1.5 目的和意义  26-28
第二章 猪代谢分泌抗原疫苗免疫效果研究  28-41
  2.1 材料  29-30
    2.1.1 弓形虫虫株及菌株  29
    2.1.2 实验动物  29-30
    2.1.3 主要实验试剂及载体  30
  2.2 方法  30-33
    2.2.1 ESA疫苗制备  30
    2.2.2 弓形虫裂解抗原(TA)的制备  30
    2.2.3 免疫  30
    2.2.4 样品采集及临床观察  30-31
    2.2.5 抗体检测  31
    2.2.6 免疫荧光实验(IFA)  31
    2.2.7 细胞免疫反应  31
    2.2.8 病理组织学检测  31
    2.2.9 基因组DNA的提取  31-32
    2.2.10 SYBR-Green 1荧光定量PCR(QF-PCR)  32-33
  2.3 结果  33-39
    2.3.1 临床症状  33-34
    2.3.2 病理解剖变化  34
    2.3.3 抗体检测结果  34-35
    2.3.4 IFA检测结果  35
    2.3.5 细胞因子检测结果  35-36
    2.3.6 组织病理学检测  36
    2.3.7 SYBR-Green 1荧光定量PCR  36-39
  2.4 讨论  39-41
第三章 多表位肽疫苗对小鼠的免疫效果研究  41-48
  3.1 材料  42
    3.1.1 弓形虫虫株  42
    3.1.2 实验动物  42
    3.1.3 主要试剂  42
  3.2 方法  42-43
    3.2.1 弓形虫裂解抗原(TA)的制备  42
    3.2.2 多肽设计与合成  42
    3.2.3 免疫和攻击  42-43
    3.2.4 抗体检测  43
    3.2.5 脾淋巴细胞的分离  43
    3.2.6 特异性淋巴细胞增殖试验  43
    3.2.7 细胞因子检测  43
    3.2.8 数据分析  43
  3.3 结果  43-45
    3.3.1 抗体反应  43-44
    3.3.2 特异性淋巴细胞增殖反应  44
    3.3.3 细胞因子试验  44-45
    3.3.4 免疫小鼠保护性试验结果  45
  3.4 讨论  45-48
第四章 弓形虫表面蛋白1(SAG1)线性B细胞抗原表位的鉴定  48-56
  4.1 材料和方法  48-50
    4.1.1 血清  48
    4.1.2 菌株与载体及主要试剂  48-49
    4.1.3 引物设计与合成  49
    4.1.4 SAG1基因PCR扩增  49
    4.1.5 SAG1基因的克隆、测序  49
    4.1.6 多肽合成  49
    4.1.7 合成肽ELISA  49-50
    4.1.8 SAG1生物信息学软件预测  50
  4.2 结果  50-54
    4.2.1 弓形虫SAG1基因的克隆  50
    4.2.2 多肽合成  50-51
    4.2.3 合成肽ELISA结果  51
    4.2.4 SAG1生物信息学软件预测结果  51-54
  4.3 讨论  54-56
第五章 弓形虫微线体蛋白1(GRA1)线性B细胞抗原表位的鉴定  56-64
  5.1 材料和方法  56-57
    5.1.1 血清  56
    5.1.2 菌株与载体及主要试剂  56
    5.1.3 引物设计与合成  56
    5.1.4 GRA1基因PCR扩增  56-57
    5.1.5 GRA1基因的克隆、测序  57
    5.1.6 多肽合成  57
    5.1.7 合成肽ELISA  57
    5.1.8 GRA1生物信息学软件预测  57
  5.2 结果  57-61
    5.2.1 弓形虫GRA1基因的克隆  58
    5.2.2 多肽合成  58
    5.2.3 合成肽ELISA结果  58-59
    5.2.4 GRA1生物信息学软件预测结果  59-61
  5.3 讨论  61-64
第六章 弓形虫合成肽ELISA的建立  64-67
  6.1 材料和方法  64-65
    6.1.1 血清样本  64
    6.1.2 ELISA操作流程  64
    6.1.3 包被浓度及样品稀释度的确定  64-65
    6.1.4 特异性和敏感性试验  65
    6.1.5 对比实验  65
  6.2 结果  65
    6.2.1 最佳包被量  65
    6.2.2 特异性和敏感性  65
    6.2.3 田间样品检测  65
  6.3 讨论  65-67
第七章 全文结论  67-68
参考文献  68-86
致谢  86-87
作者简介  87

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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