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miR-214对胃癌细胞SGC7901侵袭迁移能力的影响

作　者: 赵雪琰
导　师: 郑长黎
学　校: 中南大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: microRNA miR-214 胃癌侵袭迁移 PTEN
分类号: R735.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景：胃癌是常见的恶性肿瘤,尽管胃癌的诊断和治疗取得了一些进展,但是胃癌患者的预后仍不令人满意,浸润和转移是其预后不良的主要原因。微小RNA (microRNAs, miRNAs)是目前肿瘤研究中最受关注的生物大分子之一。研究发现miRNA在肿瘤的转移与浸润当中起了重要的作用,它们可以通过抑制靶基因的表达参与到细胞外基质降解、上皮间质转化(EMT)及肿瘤血管生成过程中,影响肿瘤的浸润转移。胃癌浸润转移相关的miRNAs研究比较少,日本学者对353例临床胃癌进行了：miRNAs表达谱分析,发现miR-214高表达是胃癌浸润深度、侵袭、淋巴结转移及分期的独立危险因素。我们前期研究中也发现胃癌细胞株BGC823、MKN45和SGC7901中miR-214的表达水平比正常胃黏膜细胞株GES-1增高。关于miR-214的靶基因及作用机制也有研究：Li等发现,在炎症反应中,miR-214通过与PTEN mRNA的3’-非翻译区结合抑制其转录翻译,使人单核巨噬细胞株THP-1凋亡延迟。Jindra等发现,在T细胞活化中,miR-214表达升高,并且与PTEN的表达水平呈负相关。有研究也发现,miR-214在卵巢癌中可以抑制PTEN的转录后翻译,激活PI3K/AKT信号通路,抑制肿瘤细胞凋亡和诱导顺铂耐药。但是miR-214是否确实为浸润转移的相关因素,尚需大量实验研究证实,其作用机制也有待深入研究。目的：探讨miR-214对胃癌细胞株SGC7901侵袭迁移能力的影响及其可能作用机制。方法：1.应用(?)miRanda革巴基因预沏测网站和TarBase数据库分析PTEN是否为miR-214靶基因,并确定PTEN mRNA与miR-214可能结合位点。2.分别瞬时转染IniR-214 mimics, inhibitors和无关序列到SGC7901细胞株,以无关序列转染组(NC组)为阴性对照,以空白转染组(control组)为空白对照,转染24h后在荧光显微镜下观察转染效率。3. Real-time PCR法检测不同转染组SGC7901细胞miR-214表达水平。4.用Western blot的方法比较不同转染组SGC7901细胞PTEN蛋白的表达。5.用Transwell侵袭小室,Transwell迁移实验和细胞划痕实验检测转染miR-214 mimics, inhibitors后SGC7901细胞侵袭迁移能力变化。结果：1.应用TarBase, miRanda发现PTEN是miR-214的靶基因之一,并且miR-2145’-种子序列区和PTEN mRNA 3’-UTR保守序列有连续的碱基互补,结合后形成的miRNA:mRNA二聚体有一定的稳定性。2.转染24h后,在荧光显微镜下观察计数,miR-214 mimics和inhibitors转染人胃癌SGC7901细胞,转染效率达80%以上3.转染24h后,Real-time PCR检测不同转染组中miR-.214的相对表达量,转染miR-214 mimics组和inhibitors组细胞中miR-214表达量分别是control组的82902.31倍,0.16倍。4. Western blot结果：SGC7901细胞转染miR-214 mimics后, PTEN蛋白相对表达水平(PTEN/GAPDH灰度比值,0.049±0.007),比转染无关序列组(0.087±0.007),转染miR-214 inhibitors组(0.093±0.010)和空白转染组(0.099±0.012)降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。5. Transwell侵袭小室实验结果：转染miR-214 mimics组侵袭细胞数为43.60±4.39,明显高于无关序列组(25.80±7.79),转染miR-214 inhibitors组(16.60±5.32)和空白转染组(24.60±6.54),差异有统计学意义(P<0.001)。而转染miR-214 inhibitors组侵袭细胞数与无关序列组,空白转染组相比较,差异无统计学意义(P>0.05)。6. Transwell迁移实验结果：转染miR-214 mimics组穿膜细胞数为39.00±6.04,明显高于无关序列组(26.20±2.39),转染miR-214 inhibitors组(20.00±2.55)和空白转染组(20.40±4.77),差异有统计学意义(P<0.05)。而转染miR-214 inhibitors组穿膜细胞数与无关序列组,空白转染组相比较,差异无统计学意义(P>0.05)7.细胞划痕实验检测结果：在不同划痕愈合时间点,转染miR-214mimics组的划痕宽度与其他三个转染组同时间点的划痕宽度窄,差异具有统计学意义(P<0.05),析因分析结果示转染因素的主效应(F=34.913,P<0.01),愈合时间的主效应(F=417.910,P<0.01)和两因素的交互作用(F=8.520,P<0.01)均具有统计学意义。结论：1.miR-214能增加胃癌细胞株SGC7901侵袭迁移能力。2.miR-214可能通过抑制PTEN的表达促进胃癌细胞侵袭迁移。

全文目录

摘要  4-7
Abstract  7-11
缩略词表及注释  11-12
前言  12-13
实验技术路线  13-14
第一章材料与方法  14-23
  1.1 实验材料  14-15
  1.2 实验方法  15-23
第二章结果  23-33
  2.1 miR-214靶基因的预测  23-24
  2.2 荧光显微镜检测SGC7901细胞miR-214 mimics,inhibitors转染效率  24
  2.3 Real-time PCR检测miR-214表达差异  24-26
  2.4 Transwell体外侵袭实验  26-28
  2.5 Transwell体外迁移实验  28-29
  2.6 细胞划痕实验  29-32
  2.7 Western blot检测各转染组细胞PTEN蛋白表达  32-33
第三章讨论  33-35
  3.1 miR-214与胃癌的关系  33-34
  3.2 miR-214与PTEN的关系  34-35
第四章结论  35-36
参考文献  36-39
综述  39-46
  参考文献  43-46
致谢  46-47
攻读硕士学位期间已完成的相关论文  47

miR-214对胃癌细胞SGC7901侵袭迁移能力的影响

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