学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

iPS细胞分化的心脏前体细胞移植改善心梗小鼠心脏功能及机制研究

作　者: 刘隽炜
导　师: 董念国
学　校: 华中科技大学
专　业: 外科学
关键词: 人脂肪干细胞重编程诱导多能干细胞无滋养细胞辅助报告基因转染定向分化心血管前体细胞心梗 PET
分类号: R542.22
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
下　载: 141次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

第一部分无滋养细胞辅助的人脂肪干细胞重编程生成诱导多功能干细胞(iPS)目的以人脂肪干细胞作为起始细胞,在无滋养细胞辅助条件下体外重编程生成诱导多能干细胞。方法从人脂肪组织中分离脂肪干细胞,通过慢病毒载体以四种转录因子转染人脂肪干细胞；无滋养细胞辅助条件下将其体外重编程为诱导多能干细胞,并以滋养细胞辅助的传统重编程方法作为对照组,比较两种方法重编程的效率；倒置相差显微镜观察细胞形态,分别取生长状态良好的2-3代细胞传入24孔培养板,XTT法检测细胞活性,并计数在不同时间点两组细胞的数量以比较其增殖能力；重编程获得的诱导多能干细胞行碱性磷酸酶和免疫荧光染色进行细胞表型鉴定；体内分化实验鉴定细胞多能型；对诱导多能干细胞基因组学进行基因芯片(Microarray)分析。结果1.将4种转录因子通过慢病毒载体转染人脂肪干细胞后,在无滋养细胞辅助条件下可将其重编程为诱导多能干细胞。与传统方法相比,使用人脂肪干细胞作为起始细胞,在无滋养细胞辅助条件下的重编程效率明显提高,且两种方法所获得的目的细胞的活性和增殖能力无统计学差异；2.细胞表型鉴定结果显示,目的细胞可表达多种胚胎干细胞样细胞因子；3.体内分化实验表明,目的细胞可分化为全部三个胚层的细胞,具有多向分化潜能；4. Microarray基因芯片结果显示,人脂肪干细胞重编程生成的诱导多能干细胞具有与人胚胎干细胞非常相似的基因表达图谱。结论人脂肪干细胞不需滋养细胞辅助,即可在较短时间内体外重编程为诱导多能干细胞,并可代替成纤维细胞作为新的重编程起始细胞。第二部分脂肪干细胞重编程诱导多能干细胞体外定向分化与报告基因转染目的将两种报告基因转染脂肪干细胞重编程的诱导干细胞,观察其对诱导多能干细胞的影响；并研究诱导多能干细胞的体外定向分化能力。方法用慢病毒载体将两种报告基因分别或共转染诱导多能干细胞,含不同报告基因的诱导多能干细胞分为A168H组,GFP-Fluc组和A168H-GFP-Fluc组,未转染组设为阴性对照,倒置相差显微镜观察转染后各组细胞形态,XTT法检测细胞活性,计数不同时间点各组细胞的数目并比较其增殖能力；体外诱导各组细胞分化,行免疫荧光染色鉴定分化细胞表型；定向诱导各组细胞向心肌细胞分化,心肌细胞标志物免疫荧光染色鉴定心肌细胞表型；体外生物发光成像技术检测HSV1-A168Htk+/GFP-Fluc+细胞数量与信号强度关系。结果1.转染不同报告基因的各组细胞形态学与对照组无差异,细胞活性和增殖能力与对照组相似；2.体外多向分化实验结果显示,各组细胞多向分化潜能无统计学差异；免疫荧光结果显示,分化细胞可表达内胚层细胞标记物Sox17,中胚层细胞标记物α-SMA或外胚层神经细胞标记物Tuj-1；3.心肌细胞定向诱导分化结果显示,多能干细胞可在特定条件下分化为跳动的心肌细胞；免疫荧光结果示,分化细胞的心肌细胞标记物a-actinin, c-TnT, nkx, mef2c均为阳性表达,进一步证实多能干细胞经体外诱导可分化为心肌细胞；4.体外生物发光成像结果说明转染报告基因HS V1-A 168Htk+/GFP-Fluc+的细胞,其成像信号与细胞数量成正相关。结论诱导多能干细胞可体外分化为全部三个胚层的细胞类型,而慢病毒载体介导的报告基因转染对细胞无不良影响,成像信号与细胞数量呈正相关,可用来在体追踪细胞生存情况。第三部分诱导多能干细胞分化的心血管前体细胞移植改善心梗小鼠心脏功能及机制研究目的观察诱导多能干细胞分化的心血管前体细胞对心梗小鼠心脏功能的改善作用,并探讨其作用机制。方法体外诱导多能干细胞定向分化为心血管前体细胞,Y计数器和PET检测报告探针体外吸收情况；建立免疫缺陷小鼠心梗模型,并随机分为hASCs-iPS-CPC高剂量注射组(n=20只),hASCs-iPS-CPC低剂量注射组(n=20只),PBS注射组(n=20只),缺氧实验组(n=10)和缺氧对照组(n=10)。各组于注射细胞后不同时间点行PET、生物发光成像在体检测移植细胞数量；术后第1、14、28天行超声心动图、MRI扫描、PV loop以检测各组小鼠心脏功能。术后28天断颈处死各组小鼠,心脏标本行H&E染色,免疫荧光和TUNEL染色。缺氧实验组每只小鼠左心室壁注射1×106个HSV1-A168Htk+/GFP-Fluc+ CPC细胞,缺氧对照组每只小鼠注射1×106个成纤维细胞,各组小鼠于术后3天处死,心脏标本冰冻切片,激光显微切割获取移植细胞行细胞因子定量分析。结果1.γ计数器计数结果和PET成像结果显示,转染HSV1-A168Htk报告基因的hASCs-iPS-CPC细胞对PET探针18F-FHBG的吸收随着孵育时间的延长而上升,120分钟左右达到最高值。2.术后不同时间点对各组实验动物分别行PET扫描,结果显示移植细胞后的小鼠于术后第1天即可观察到很强的心脏PET信号,随着时间的推移,PET信号逐渐减弱,而PBS对照组小鼠则未发现PET信号。BLI成像也显示了与PET相同的结果。3.心功能检测显示,各组小鼠术后第1天心功能均较前明显下降,高剂量组术后第14天LVFS (P=0.0143)及LVEF (P=0.0354),术后28天LVFS (P=0.0284)及LVEF (P=0.0356)与低剂量组和PBS组相比均明显升高,且差异有统计学意义。术后28天PV loop检测结果示高剂量组ESV (P=0.0041)、EDV (P=0.0093)、ESP(P=0.0016)较低剂量组和PBS组显著升高。4.不同时间点的LVFS与第一天PET信号结果联合分析显示,术后28天心功能与PET信号之间存在较明显的相关性(R2=0.72)。5.各组小鼠心脏标本H&E染色结果示,高剂量组左心室壁厚度较低剂量组和PBS组明显增加。免疫荧光染色结果示,高剂量组左心室心肌组织中可见部分移植细胞存活,而低剂量组和PBS组仅极少量移植细胞或未见移植细胞存活。TUNEL染色示,高剂量组凋亡细胞数量较前两组明显降低。6.体内和体外实验结果均显示,缺氧后CPC内血管生成因子含量与成纤维细胞相比明显升高。结论诱导多能干细胞分化的心血管前体细胞可显著改善小鼠心梗后的心脏功能；PET扫描能实时定量的追踪体内移植细胞,并对细胞移植的疗效做出早期判断。

全文目录

中英文缩略词表  6-7
中文摘要  7-11
Abstract  11-16
前言  16-22
第一部分无滋养细胞辅助的人脂肪干细胞重编程生成诱导多功能干细胞  22-39
  材料  23-25
  方法  25-31
  结果  31-32
  讨论  32-33
  参考文献  33-36
  附图  36-39
第二部分脂肪干细胞重编程诱导多能干细胞体外定向分化与报告基因转染  39-59
  材料  40-41
  方法  41-49
  结果  49-50
  讨论  50-52
  参考文献  52-55
  附图  55-59
第三部分诱导多能干细胞分化的心血管前体细胞移植改善心梗小鼠心脏功能及机制研究  59-86
  材料  60-63
  方法  63-71
  结果  71-73
  讨论  73-75
  参考文献  75-79
  附图  79-86
结论与创新点  86-87
展望  87-88
综述  88-104
  参考文献  95-104
附录  104-105
致谢  105-106

iPS细胞分化的心脏前体细胞移植改善心梗小鼠心脏功能及机制研究

内容摘要

全文目录

相似论文