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肉桂链霉菌PLD基因原核表达载体构建及表达条件优化

作　者: 龚跟强
导　师: 崔玉东；邱并生
学　校: 黑龙江八一农垦大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 肉桂链霉菌 PLD E. coli pET-26(b+) pEZZ18
分类号: Q786
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

本文致力于研究一种被广泛关注的重要工业用途的酶,即链霉菌(Stv. Cinnamoneum)来源的磷脂酶D。它对多种磷脂均具有水解和转磷脂活性,可高效、持续转化磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)生成磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)。因此磷脂酶D是很有前景的催化剂,可合成具有各样生理功能的多种极性头基的新型磷脂,广泛应用于食品、化妆品和医药工业。然而,磷脂酶D因在微生物中的低产率已严重羁绊了其在理论及应用酶学方面的深入研究。在构建分泌磷脂酶D表达系统前,就已有许多研究学者试图用大肠或毕赤酵母作为宿主菌在细胞内分泌表达磷脂酶D。然而,研究发现磷脂酶D对这些宿主细胞有极强的细胞毒性,一旦表达了有活性的磷脂酶D就会立即引发严重的细胞溶解,这很可能是活性磷脂酶D将宿主细胞膜中的磷脂降解所致。因此,很有必要研究磷脂酶D在原核宿主中分泌表达的可行性,为工业化生产提供一定的理论依据。本研究利用本身携带信号肽的pET-26b (+)、pEZZ18质粒作为表达载体,E.coli w+ Rosetta、E.coli JM105作为宿主菌,Stv. Cinnamoneum来源的磷脂酶D基因作为扩增目的片段构建了原核表达系统,并成功的在细胞周质表达出具可溶活性的磷脂酶D。并进一步优化了诸如,诱导剂浓度、葡萄糖浓度和培养基组成等可影响磷脂酶D表达产量、活性的各种实验参数。最终,构建的pEZZ18-PLD/ JM105、pET26b(+) -PLD/W+ Rosetta原核表达系统在葡萄糖添加终浓度均为0.5%,温度分别为18℃、28℃,IPTG浓度为0.5mM,OD600值分别为0.75、0.85时目的蛋白PLD的表达含量达到最高,分别为0.8mg/L、1.1mg/L;活性则分别达到0.62×103 U/L、0.86×103 U/L。本研究构建的磷脂酶D原核表达系统使表达的磷脂酶D产量、活性都得到了进一步提高,虽然不够理想,但仍可为磷脂酶D基础理论研究和磷脂工业化生产提供一定的借鉴和参考。

全文目录

中文摘要  3-4
Abstract  4-7
第一章文献综述  7-14
  1.1 引言  7-8
  1.2 磷脂酶D 的性质及研究现状  8-11
  1.3 磷脂酶D 的活力检测方法  11-12
  1.4 磷脂酶D 的应用  12-13
  1.5 小结  13-14
第二章材料与方法  14-24
  2.1 材料  14-16
  2.2 方法  16-24
第三章实验结果  24-38
  3.1 Stv.cinnamoneum PLD 基因的 PCR 扩增结果  24
  3.2 Stv.cinnamoneum PLD 基因的 T-A 克隆及序列测定结果  24-27
  3.3 PLD 基因重组表达载体的构建结果  27-30
  3.4 原核系统表达PLD 的SDS-PAGE 结果  30-33
  3.5 表达产物PLD 活性检测结果  33-34
  3.6 表达条件优化结果  34-37
  3.7 PLD 蛋白纯化及定量结果  37-38
第四章讨论  38-39
第五章结论  39-40
参考文献  40-47
致谢  47-48
附录  48-54
简历  54

肉桂链霉菌PLD基因原核表达载体构建及表达条件优化

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