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阳离子聚合物介导的基因输送在复合组织再生修复中的应用及免疫效应研究

作　者: 陈欢
导　师: 张峻峰
学　校: 南京大学
专　业: 生物学
关键词: 软骨-骨复合组织工程原位基因输送骨髓间充质干细胞生物相容性阳离子聚合物 TLR-4 Th1分化类风湿性关节炎
分类号: R318.08
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

由多种细胞按照一定空间结构次序组成的复杂组织或器官的工程化再生修复一直是组织工程面临的挑战。关节软骨-骨复合组织的组织工程一直倍受关注,是复杂组织再生修复一个理想的研究模型。本论文的第一部分内容主要是结合骨髓间充质干细胞的多向分化潜能、组织工程双层支架体系和非病毒原位基因输送体系,选用与天然软骨基质主要成分相似的壳聚糖和明胶作为软骨层支架材料,而将骨组织工程中广泛使用的羟基磷灰石/壳聚糖-明胶复合物用来模拟天然骨基质成分,将原位基因输送体系应用于双层支架中,来诱导不同层的骨髓间充质干细胞向不同方向分化：1)将质粒DNA TGF-β1载入壳聚糖-明胶支架作为软骨诱导层(上层),而将质粒DNA BMP-2载入羟基磷灰石/壳聚糖-明胶支架作为成骨诱导层(下层),构建了双基因活化的双层支架,然后将骨髓间充质干细胞植入双基因活化的双层支架中,使上下两层骨髓间充质干细胞分别在基因TGF-β1和BMP-2诱导下,分别特异性地向软骨细胞和成骨细胞分化,用纤维蛋白胶将两层支架整合在一起并进行体外培养,可形成软骨-骨移植复合体；2)将体外构建的软-骨复合体移植到兔关节软骨-骨全层缺损部位,进行体内软骨-骨复合组织的同时修复。研究结果如下：1)扫描电镜和细胞增殖实验显示,双层支架材料本身就具有良好的生物相容性,在双基因的活化下,上下两层细胞的生长增殖能力进一步提高；2)ELISA实验表明,该双层支架是一个很有效的双基因原位转染体系,软骨层支架的MSC能有效地表达TGF-β1蛋白,而成骨层支架的MSC能高效地表达BMP-2蛋白,而且双层共培养不会影响各层细胞各自转染基因的表达；3)实时定量PCR和免疫组织化学结果显示,在我们构建双基因活化的双层复合支架体系中,TGF-β1基因活化的软骨层MSC能特异性地向软骨细胞分化,而BMP-2基因活化的成骨层MSC能定向地向成骨细胞分化,双层共培养不会干扰各层细胞各自的分化,但能促进了两层间的相互整合,表明能在体外成功构建软骨-骨移植复合体；4)这种软骨-骨复合体用于体内关节缺损修复后,无论从外观还是免疫组织化学结果,我们都可以看出：双基因活化的软骨-骨复合体很好地实现了对表层透明软骨和软骨下骨复合组织的同时修复,取得了比任何单基因活化的单层支架体系更好的修复效果。从而证明了结合骨髓间充质干细胞的多向分化潜能、组织工程双层支架体系和非病毒原位基因输送体系,能有效在体内外促进软骨-骨复合组织的再生,从而为复杂组织的再生提供了简单有效的策略参考。广泛用于医药领域的生物材料对于宿主来说是异物,所以免疫反应是生物材料的生物相容性一个重要考虑因素。本论文的第二部分内容主要研究了阳离子聚合物的免疫学效应,利用其免疫效应对佐剂诱导的类风湿性关节炎进行了治疗,并研究了其中的分子机制。阳离子聚合物,PEI、PLL、阳离子化的葡聚糖(C-dextran)和阳离子化的明胶(C-gelatin)能提高脾细胞中CD4+T细胞的比例,并促进其IFN-γ和TNF-α的表达,诱导Th1细胞分化,并主要是通过促进巨噬细胞表达Th1诱导因子-IL-12来实现的。同时阳离子聚合物能特异性地阻止脂多糖刺激的巨噬细胞TNF-α的分泌,暗示阳离子聚合物可能能和TLR-4相互作用。MyD88抑制多肽、抗TLR-4的中和抗体能阻止这些阳离子聚合物引起的巨噬细胞IL-12的分泌,抑制率均为60%左右,证明阳离子聚合物主要是通过与巨噬细胞的TLR-4结合来促进IL-12表达的。实验结果还显示,阳离子聚合物对巨噬细胞IL-12分泌的刺激效应主要与其阳离子化程度和分子量相关。利用阳离子聚合物的免疫效应,我们发现阳离子聚合物能抑制类风湿性关节炎的发展。对治疗后大鼠血清细胞因子测定中,我们发现治疗组的IFN-γ和IL-12较模型组有所提高,而在IFN-γ受体敲除小鼠和巨噬细胞清除小鼠关节炎模型中,阳离子聚合物的抗炎效果消失,说明IFN-γ和巨噬细胞在阳离子聚合物治疗关节炎中发挥了重要的作用。同时,我们还发现经阳离子聚合物治疗,关节局部的中性粒细胞浸润减少。所以,我们推断阳离子聚合物能通过与TLR-4结合,刺激巨噬细胞分泌IL-12,IL-12进一步作用于其靶细胞,促进靶细胞分泌IFN-γ,而IFN-γ抑制了中性粒细胞往炎症关节的迁移,从而减轻了关节局部的炎症。

全文目录

摘要  5-8
Abstract  8-11
研究特色和创新  11-12
缩写词表  12-13
第一章: 前言  13-60
  1.1 组织工程  13-19
    1.1.1 组织工程的产生和定义  13
    1.1.2 组织工程的策略和要素  13-18
    1.1.3 组织工程的发展  18-19
  1.2 复杂组织的工程化再生  19-29
    1.2.1 复杂组织再生的挑战  20
    1.2.2 复杂组织中血管的构建  20-22
    1.2.3 复杂组织中多细胞有序结构的构建  22-23
    1.2.4 多层支架体系在复杂组织再生中的应用  23-24
    1.2.5 干细胞在复杂组织再生中的应用  24-26
    1.2.6 基因传输技术在复杂组织再生中的应用  26-29
  1.3 软骨-骨复合组织的组织工程研究  29-38
    1.3.1 软骨-骨复合组织的结构和功能  29-31
    1.3.2 软骨-骨复合组织工程研究进展  31-38
  1.4 生物材料的免疫效应  38-51
    1.4.1 生物材料及其生物相容性  38-45
    1.4.2 Toll样受体  45-48
    1.4.3 IL-12和Th1响应  48-51
  参考文献  51-60
第二章: 基于MSCs的双基因空间定向活化的软骨-骨复合组织再生体系的构建  60-100
  2.1 MSCs在TGF-β 1和BMP-2双基因活化的双层支架中的体外增殖及分化研究  60-80
    前言  60-62
    2.1.1 实验材料  62
    2.1.2 实验方法  62-70
    2.1.3 结果及讨论  70-78
    2.1.4 小结  78-80
  2.2 双基因活化的软骨-骨移植复合体用于体内关节软骨-骨缺损修复  80-97
    前言  80-81
    2.2.1 实验材料  81
    2.2.2 实验方法  81-83
    2.2.3 结果及讨论  83-96
    2.2.4 小结  96-97
  参考文献  97-100
第三章: 阳离子聚合物的免疫效应研究  100-137
  3.1 阳离子聚合物通过与TLR-4结合引起Th1响应  100-122
    前言  100-101
    3.1.1 实验材料  101-102
    3.1.2 实验方法  102-108
    3.1.3 实验结果  108-118
    3.1.4 讨论及小结  118-122
  3.2 利用阳离子聚合物的免疫效应治疗类风湿性关节炎  122-133
    前言  122-123
    3.2.1 实验材料  123
    3.2.2 实验方法  123-125
    3.2.3 实验结果  125-132
    3.2.4 小结  132-133
  参考文献  133-137
附录攻读博士学位期间发表的部分学术论文  137-138
致谢  138-140

阳离子聚合物介导的基因输送在复合组织再生修复中的应用及免疫效应研究

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