学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

DLL1基因在小鼠B16黑色素瘤形成中的作用研究

作　者: 张建平
导　师: 王春梅；韩骅
学　校: 第四军医大学
专　业: 细胞生物
关键词: Notch信号通路 DLL1基因细胞转染黑色素瘤血管生成
分类号: R739.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 23次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

Notch信号通路是进化上高度保守的细胞与细胞间的信号传导系统,通过调控细胞的分化、增殖、凋亡的命运选择,在胚胎正常发育、机体稳态调控以及成体干细胞的维持中发挥重要作用。在胚胎血管发育过程中,Notch信号通路调控着动静脉血管的分化和血管内皮Tip细胞和Stalk细胞的命运选择,对胚胎血管网络正常结构和功能的维持起到了关键作用。Notch信号通路调控的异常往往由于血管网络发育的缺陷而导致胚胎死亡。在成体生理性新生血管形成中,Notch信号通路的激活限制了血管的过度生成,维持了机体的稳定。在肿瘤血管中,DLL4的表达显著增高,阻断DLL4激活的Notch信号通路引起了肿瘤血管的无功能性过度生成,使肿瘤的血流灌注减少而抑制了肿瘤的生长;而过表达DLL4虽然肿瘤血管的生成,但却改善了肿瘤血管的结构和灌流功能,促进了肿瘤的生长。但与此同时,也有研究证实Notch的另一配体Jagged1能通过促进肿瘤的功能血管的形成而促进肿瘤的生长。鉴于Notch信号通路的调控作用环境依赖性(Context-dependent)和Notch分子间的功能特异性,我们检测了另外一个Notch配体DLL1在肿瘤血管中的作用。DLL1调控胚胎期动静脉血管的分化和成体损伤后血管的形成。但其在肿瘤血管中的作用还没有详细的研究报道。我们在DLL1与肿瘤血管的研究中主要做了以下工作:1、构建共表达DLL1蛋白和绿色荧光蛋白(GFP)的真核表达质粒。通过设计特异引物,利用PCR方法扩增出DLL1基因片段,测序正确后连接通过到pIRES2-EGFP质粒中;然后对新构建的pIRES2-EGFP-DLL1质粒进行了酶切鉴定和测序。2、在体外实验中发现DLL1的表达促进肿瘤细胞的体外增殖。通过分别转染pIRES2-EGFP-DLL1质粒和pIRES2-EGFP质粒,药物筛选建立了稳定表达DLL1基因和GFP基因的B16黑色素瘤细胞系;检测发现DLL1激活了肿瘤细胞Notch信号通路;MTT和软琼脂克隆形成实验表明DLL1的表达促进了肿瘤细胞的增殖和克隆的形成。3、观查到DLL1通过减少肿瘤血管的生成抑制了肿瘤在小鼠体内的生长。小鼠皮下荷瘤实验发现实验组肿瘤在小鼠体内的生长长受到抑制,基因检测发现Notch通路在肿瘤中激活,免疫荧光和免疫组化实验证实血管肿瘤中血管形成减少,肿瘤组织血供障碍,缺氧程度加重,坏死增加。结论:综上所述,我们的研究认为DLL1在肿瘤细胞中的表达能通过肿瘤细胞间的相互作用激活HES1、HEY1等Notch下游基因,促进肿瘤细胞的增殖和克隆的形成。但在B16-DLL1肿瘤在小鼠体内的生长并没有相应的加速,反而受到了抑制。可能原因是肿瘤的快速增殖需要与营养的供应相适应,而DLL1的表达一方面促进了肿瘤细胞的增殖,另一方面却使肿瘤血管的生成减少,结构紊乱,扰乱了肿瘤的血液供应,加重了肿瘤内部缺血缺氧情况,使肿瘤组织坏死增加,从而抑制了肿瘤的生长。

全文目录

缩略语表  6-8
中文摘要  8-10
英文摘要  10-13
前言  13-15
文献回顾  15-26
  一、Notch 信号通路  15-18
  二、Notch 信号通路对血管形成的作用  18-21
  三、Notch 在肿瘤血管中的作用  21-25
  五、Notch 信号通路与黑色素瘤生长的关系  25-26
实验一载体的构建  26-36
  1 实验材料和仪器  26-28
    1.1 菌株、质粒和工具酶  26
    1.2 主要试剂  26
    1.3 主要工作试剂配制  26-27
    1.4 主要仪器  27-28
  2 实验方法  28-29
    2.1 引物设计  28
    2.2 目的基因的扩增  28
    2.3 目的基因表达载体构建  28-29
  3 实验结果  29-34
    3.1 D1、D2 基因片段的PCR扩增  29-30
    3.2 D1、D2 PCR片段的测序  30-33
    3.2 pIRES2-EGFP-DLL1 质粒的鉴定和测序  33-34
  讨论  34-36
实验二 DLL1 基因在小鼠黑色素瘤细胞中的表达及功能  36-46
  1 材料与仪器  36-37
    1.1 细胞  36
    1.2 主要试剂  36
    1.3 主要溶液  36
    1.5 主要仪器  36-37
  2 实验方法  37-41
    2.1 细胞转染  37-38
    2.2 DLL1 在细胞中表达的鉴定  38-39
    2.3 细胞体外实验  39-41
  3 结果  41-43
    3.1 细胞的转染  41
    3.2 DLL1 在转染细胞中的表达  41-42
    3.3 DLL1 对下游靶基因的激活  42-43
    3.4 DLL1 对肿瘤细胞体外增殖的作用  43
  4 讨论  43-46
实验三 DLL1 对肿瘤体内生长的作用  46-54
  1 仪器与材料  46-47
    1.1 实验材料  46
    1.2 主要试剂  46
    1.3 主要溶液  46-47
    1.4 主要仪器  47
  2 实验方法  47-49
    2.1 肿瘤细胞接种  47
    2.2 肿瘤生长观察  47
    2.3 Evans blue 灌注实验  47
    2.4 肿瘤组织RNA的提取  47
    2.4 Real-time PCR 检测  47-48
    2.5 组织学分析  48-49
  3 结果  49-51
    3.1 小鼠荷瘤实验  49
    3.2 Notch信号通路在肿瘤组织中的激活  49-50
    3.3 Notch对肿瘤血管的影响  50-51
    3.4 肿瘤的缺血和坏死  51
  4 讨论  51-54
小结  54-55
参考文献  55-65
个人简历和研究成果  65-66
致谢  66

DLL1基因在小鼠B16黑色素瘤形成中的作用研究

内容摘要

全文目录

相似论文