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SPR传感检测细胞表面分子相互作用的方法研究

作　者: 刘芳芳
导　师: 余兴龙
学　校: 清华大学
专　业: 仪器科学与技术
关键词: 表面等离子体共振噬菌体展示蛋白质芯片细胞芯片人胃癌BGC823细胞表皮生长因子受体
分类号: Q26
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

体外分子水平研究对于了解DNA和蛋白质的最基本的结构及功能具有重要的意义,而要更全面地理解生命过程的本质及其生理和病理机制,则有必要扩展到细胞、组织乃至个体水平上。随着功能基因组研究的深入,细胞水平的分子研究已成为生物医学研究的热点之一,随之要求发展不同的研究方法。实现细胞水平上无标记、高灵敏、实时的分子检测是该领域面临的一个主要挑战,本论文将SPR传感与细胞上的分子检测相结合,力求摸索一种新方法,为细胞生物学以及药物发现研究创造条件,完成的主要研究内容有:SPR传感用于细胞表面分子检测可行性的理论分析。根据麦克斯韦方程组和菲涅尔公式,对SPW的相关特性进行了理论分析,数值模拟了SPW的传播长度以及穿透深度与激发波长的关系,进而建立了SPR传感细胞的2种物理模型并作了分析。分析结果表明,细胞水平的分子反应能被SPR传感。SPR传感检测噬菌体上分子反应的方法摸索。以展示有12肽的噬菌体M13作为探针,制备了噬菌体展示蛋白质芯片,并实时检测了该12肽与其相应抗体相互作用的过程,实验结果表明SPR传感可检测活体上的分子反应。同时,这也为进一步制备细胞芯片和相关实验研究奠定了基础。SPR传感检测人胃癌BGC823细胞膜蛋白EGFR与其抗体EGFR1反应过程的实验研究。在改进实验装置的基础上,制备了2种类型的BGC823细胞芯片,检测了其膜蛋白EGFR与抗体EGFR1的反应过程,并与免疫荧光实验对照,结果表明,SPR传感能检测到细胞表面的分子反应。继而,与羊抗兔IgG检测结果对照,验证了EGFR1结合的特异性;在不同浓度的EGFR1下进行反应检测,得到细胞的不同响应检测值。针对实验中信号混合的问题,还提出了双波长SPR传感分层检测的构思。综上所述,SPR传感具有检测细胞表面分子反应过程的可行性,所完成的工作为后续研究创造了条件,显示出SPR传感成为一种细胞水平分子检测实用技术的潜在可能性。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
主要符号对照表  10-11
第1章绪论  11-29
  1.1 概述  11-20
    1.1.1 在细胞水平进行分子检测的意义  11-12
    1.1.2 细胞检测技术的研究现状  12-18
    1.1.3 细胞检测技术存在的问题和难点  18-20
  1.2 基于SPR 传感的细胞检测  20-27
    1.2.1 SPR 现象和传感原理  20-22
    1.2.2 基于SPR 传感的细胞检测技术概述  22-26
    1.2.3 SPR 传感检测细胞的优点及存在的问题  26-27
  1.3 课题内容和意义  27-28
  1.4 论文内容介绍  28-29
第2章 SPR 传感检测细胞的理论分析  29-46
  2.1 SPR 传感模型  29-31
  2.2 SPW 的特性  31-37
    2.2.1 SPW 的电磁场特性  31-32
    2.2.2 SPW 传播特性的数值仿真  32-36
    2.2.3 SPW 的穿透深度与激发波长的关系  36-37
  2.3 SPR 传感检测细胞的模型建立及分析  37-44
    2.3.1 细胞的等效折射率  37-38
    2.3.2 SPR 传感检测细胞的物理模型  38-39
    2.3.3 SPR 传感灵敏度分析  39-44
  2.4 本章小结  44-46
第3章 SPR 传感检测细胞的前期实验研究  46-58
  3.1 基本考虑  46
  3.2 检测实验方案的建立  46-48
    3.2.1 模式系统的选择  46-47
    3.2.2 抗体的选择  47
    3.2.3 检测仪器  47-48
  3.3 传感芯片的制备  48-53
    3.3.1 芯片表面的化学修饰  48-51
    3.3.2 探针分子的耦联  51-53
  3.4 噬菌体展示蛋白质芯片的检测实验  53-57
    3.4.1 特异性实验  53-55
    3.4.2 梯度浓度实验  55-56
    3.4.3 重复性实验  56-57
    3.4.4 实验结果分析  57
  3.5 本章小结  57-58
第4章胃癌BGC823 细胞的检测实验条件优化  58-76
  4.1 胃癌BGC823 细胞及其膜蛋白EGFR 的特性  58-59
    4.1.1 胃癌BGC823 细胞  58
    4.1.2 膜蛋白EGFR  58-59
  4.2 实验装置的改进  59-67
    4.2.1 时域调制SPR 相位检测装置  60-61
    4.2.2 微流体池  61-65
    4.2.3 信号处理与解析  65-67
  4.3 BGC823 细胞芯片的制备及检测条件优化  67-75
    4.3.1 芯片表面化学修饰方法的选择  68-69
    4.3.2 细胞芯片制备方法的选择  69-72
    4.3.3 检测过程中保持细胞活性的措施  72-73
    4.3.4 减少非特异性信号的措施  73-74
    4.3.5 制备及检测细胞芯片的流程  74-75
  4.4 本章小结  75-76
第5章胃癌BGC823 细胞检测实验及改进的设想  76-99
  5.1 抗体与细胞芯片反应位置验证  76-77
  5.2 基于单波长SPR 传感的BGC823 细胞检测实验  77-87
    5.2.1 实验方法  77-78
    5.2.2 细胞状态监测  78-79
    5.2.3 活细胞与固定细胞的实验对比  79-81
    5.2.4 EGFR1 与BGC823 细胞反应过程的监测  81-83
    5.2.5 EGFR1 浓度对BGC823 细胞生理功能的影响  83-85
    5.2.6 重复性实验  85-86
    5.2.7 5100A14 抗体与BGC823 细胞反应的检测  86-87
  5.3 实验结果分析  87-90
    5.3.1 SPR 传感信号的可信性分析  87
    5.3.2 实验结果量化分析  87-89
    5.3.3 传感信号存在的问题  89-90
  5.4 改进的设想  90-98
    5.4.1 双波长SPR 分层检测的基础  90
    5.4.2 分层检测模型的建立  90-91
    5.4.3 分层信号提取的数据解析模型  91-92
    5.4.4 双波长SPR 分层信号提取的数值模拟  92-96
    5.4.5 双波长SPR 传感系统结构的构思  96-98
  5.5 本章小结  98-99
第6章结论及展望  99-102
  6.1 主要研究成果  99-100
  6.2 主要创新点  100
  6.3 问题与展望  100-102
参考文献  102-110
致谢  110-111
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  111-112

SPR传感检测细胞表面分子相互作用的方法研究

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