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马铃薯Y病毒CP基因不同区段对发夹RNA和人工的miRNA介导的病毒抗性的影响

作　者: 姜芳
导　师: 温孚江；朱常香
学　校: 山东农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 马铃薯Y病毒 外壳蛋白基因 不同区段 人工miRNA 发夹RNA RNA沉默 RNA介导的病毒抗性
分类号: S432.41
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


基因沉默是生物体长期以来形成的一种防御机制,阻止外源基因、转座因子、病毒等外源核酸的侵入,保护生物基因组的完整性。小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)和微小RNA(microRNA, miRNA)是两种序列特异性地转录后基因表达的调节因子,是沉默RNA的最主要组成部分。RNA介导的病毒抗性(RNA mediated virus resistance, RMVR)是RNA沉默的一种表现形式,侵入植物细胞的病毒基因组与转基因转录产物具有部分同源性,因此在转录后基因沉默所导致的RNA降解过程中,RNA降解系统识别侵入细胞内的病毒基因组并将其与转基因RNA一起降解。RMVR具有抗病程度高(近乎免疫)、抗性持久、生物安全性高等优点。在基因沉默的研究中已发现“位置效应”的存在,siRNA的有效性可能受到靶序列所处的位置影响。在RNA介导的植物病毒抗性研究中,目前尚未见有关“位置效应”的系统报道。本研究以马铃薯Y病毒外壳蛋白为靶基因分别以hpRNA和人工的miRNA两种方式构建RNA干扰的植物表达载体,系统性的比较PVY CP基因不同区段对RNA介导的病毒抗性的影响,为寻找引发基因沉默的有效片段及更好利用RMVR培育抗病毒转基因植物提供了依据。研究结果和主要结论如下:(1)马铃薯Y病毒CP基因不同区段对发夹RNA介导的病毒抗性的影响将PVY CP基因人工的划分为16段各50bp的区段。通过PCR扩增,得到相应的不同区段的正向和反向的片段,通过酶切连入植物表达载体pROKⅡ中;热激法转化大肠杆菌DH5α,筛选并获得hpRNA结构的植物表达载体pROK CPs(pROK CP9~pROK CP16)。用成功构建的16个植物表达载体(另外8个为吴斌构建)瞬时侵染本生烟验证其有效性,Northern Blot结果显示,16个植物表达载体均能在植物体内成功表达产生siRNA,且瞬时表达的siRNA能有效地下调靶基因PVY CP的表达。将构建的8个植物表达载体利用冻融法导入农杆菌LBA4404。叶盘法转化烟草NC89,经卡那霉素抗性筛选和PCR检测确定转基因植株。T0代转基因植株自交,种子置于含卡那霉素的筛选培养基上进行筛选,共得到的pROK CP9~pROK CP16各50株、62株、56株、55株、45株、63株、72株和55株T1代转基因植株。抗病性分析发现除了转基因株系pROK CP1、pROK CP2、pROK CP3、pROK CP4未获得抗性植株外,其余12个转基因株系中抗性植株的比例分别为27.15%、6.27%、67.65%、70.83%、66.01%、61.34%、66.04%、23.59%、11.11%、55.56%、77.78%和67.25%。结果表明在利用hpRNA介导的抗PVY病毒的研究中,以PVY CP基因上的50bp序列为茎足以介导宿主植株的基因沉默的产生,但由于hpRNA靶位置的差异产生不同的抗病效率,靶向于3′端nt701~nt750区段表现最高水平的抗性;且以CP基因3′端为靶序列的hpRNA转基因植株比以5′端为靶序列的植株更能有效地介导对PVY的抗性。转基因植株的Northern杂交分析表明,转基因都在RNA水平上得到了表达,抗病植株中RNA的积累量明显低于同类型的感病植株,抗性与RNA积累量呈负相关,证实病毒抗性是由RNA介导的;对转基因植株的siRNA表达量的分析,表明植株对病毒的敏感程度与siRNA积累量之间没有明显的相关性。对T2代的转基因植株的抗病性分析结果发现,几乎所有的抗性转基因植株的后代均表现很强的抗病毒侵染能力,说明由hpRNA介导的PVY抗性在T2代植株中能够稳定遗传。(2)马铃薯Y病毒CP基因不同区段对人工的miRNA介导的病毒抗性的影响以PVY CP基因的全长cDNA序列为靶基因,根据miRNA的特征选取8个不同的位置,M1(nt96~nt115)、M2(nt140~nt159)、M3(nt322~nt341)、M4(nt380~nt399)、M5(nt475~nt494)、M6(nt567~nt586)、M7(nt679~nt698)和M8(nt735~nt754)为amiRNA的靶区。选用拟南芥miR319a前体作为amiRNA表达的骨架,通过PCR扩增的方式替代掉原有的pre miR319a中具有生物学功能的miRNA和miRNA*,得到含有amiRNA和amiRNA*的DNA片段。将扩增产物连入植物表达载体pROKⅡ中。热激法转化大肠杆菌DH5α,筛选并获得重组表达载体pROK amiRcp1~pROK amiRcp8。用构建的amiRNA表达载体瞬时侵染本生烟,Northern Blot验证其有效性,结果显示,8个amiRNA植物表达载体均能在植物体内成功表达amiRNA,且瞬时表达的amiRNA能有效地下调靶PVY CP基因的表达。将成功构建的amiRNA表达载体利用冻融法导入农杆菌LBA4404。叶盘法转化烟草NC89。再生植株经卡那霉素抗性筛选和PCR检测确定为转基因植株。T0代自交后,经卡那霉素筛选和PCR鉴定,分别获得pROK amiRcp1~pROK amiRcp8的T1代转基因植株98株、96株、114株、116株、117株、111株、110株和116株。抗病性结果显示,表达靶向于马铃薯Y病毒CP基因的amiRNA转基因植株能介导对马铃薯Y病毒的抗性,抗性比例分别为37.68%、50.29%、53.76%、37.75%、29.86%、17.05%、26.27%、64.69%。针对马铃薯Y病毒CP基因不同区段设计的amiRcps其转基因植株所介导的抗病性效果之间存在差异,靶向于3′端的amiRcp 8(nt735~nt754)能表现更高水平的抗性。转基因植株的Northern杂交分析表明,转基因都在RNA水平上得到了表达,且植株的抗性与转基因的表达量成负相关,表明amiRNA介导的病毒抗性是由RNA介导的。对转基因植株的amiRNA的Northern Blot分析,结果显示,所有抗病转基因植株中都有amiRNA存在,且植株的抗性与amiRNA的表达量成正相关。对T2代的转基因植株的抗病性分析结果发现,所有的抗性转基因植株的后代都表现高的抗病率,表明由amiRNA介导的PVY抗性在T2代植株中能够稳定遗传。

全文目录


中文摘要  10-13
英文摘要  13-16
1 前言  16-37
  1.1 基因沉默  16-17
  1.2 沉默RNA  17-22
    1.2.1 小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）  17-18
    1.2.2 微小RNA（microRNA，miRNA）  18-19
    1.2.3 siRNA 和miRNA 的联系和区别  19-21
    1.2.4 其他参与沉默的小分子RNA  21-22
  1.3 RNA 沉默的作用机制  22-24
    1.3.1 siRNA 途径  23
    1.3.2 miRNA 途径  23-24
  1.4 RNA 介导的病毒抗性  24-28
    1.4.1 RNA 介导的病毒抗性的特点  26-27
    1.4.2 RNA 介导的病毒抗性是转录后基因沉默的结果  27-28
  1.5 基于siRNA 的抗病毒策略  28-29
  1.6 植物抗病毒研究中高效的发夹RNA 植物表达载体的构建  29-31
    1.6.1 hpRNA 茎结构长度的影响  29-30
    1.6.2 hpRNA 环区域的影响  30
    1.6.3 核酸序列同源性的影响  30-31
    1.6.4 转录速度的影响  31
  1.7 基于miRNA 的抗病毒策略  31-32
  1.8 人工miRNA 技术的影响因素  32-34
    1.8.1 amiRNA 序列的设计与优化  32-33
    1.8.2 天然的miRNA 前体的选择  33-34
  1.9 马铃薯Y 病毒与抗病毒基因工程  34-35
  1.10 本研究的目的及其意义  35-37
2 材料与方法  37-59
  2.1 材料  37
    2.1.1 毒源  37
    2.1.2 供试植物  37
    2.1.3 菌株、质粒  37
  2.2 方法  37-59
    2.2.1 构建含发夹结构的转基因植物表达载体  37-39
      2.2.1.1 植物表达载体的构建策略  37-38
      2.2.1.2 PCR 扩增特异性引物设计  38-39
    2.2.2 构建amiRNA 转基因植物表达载体  39-42
      2.2.2.1 植物表达载体的构建策略  40
      2.2.2.2 amiRNA 的筛选  40
      2.2.2.3 引物的设计  40-42
    2.2.3 PCR 扩增目的片段  42
    2.2.4 目的片段与克隆载体的连接  42
    2.2.5 目的片段和质粒DNA 的酶切  42-43
    2.2.6 DNA 片段的回收（试剂盒法）  43
    2.2.7 目的片段与质粒DNA 的连接  43-44
    2.2.8 感受态细胞的制备  44
    2.2.9 质粒DNA 向大肠杆菌中转化（热激法）  44
    2.2.10 转化菌落PCR 鉴定  44-45
    2.2.11 质粒DNA 的大量提取（碱性SDS 法）  45-47
    2.2.12 重组质粒的酶切鉴定  47
    2.2.13 重组质粒向农杆菌转化（冻融法）  47
    2.2.14 农杆菌介导的瞬时侵染  47-48
    2.2.15 农杆菌介导的烟草转化  48-49
    2.2.16 植物总DNA 的提取（CTAB 法）  49
    2.2.17 转基因植株的PCR 检测  49
    2.2.18 转基因植株的抗病性鉴定及ELISA 检测  49-50
      2.2.18.1 转基因植株的抗病性鉴定  49-50
      2.2.18.2 转基因植株的ELISA 检测  50
    2.2.19 Northern 杂交分析  50-55
      2.2.19.1 转基因植株总RNA 的提取（Trizol 一步提取法）  50-51
      2.2.19.2 在含有甲醛的凝胶上进行RNA 电泳  51
      2.2.19.3 转膜  51-52
      2.2.19.4 探针制备  52-53
      2.2.19.5 DIG 标记有效性检测  53-54
      2.2.19.6 杂交  54-55
    2.2.20 转基因植株siRNA/miRNA 的提取及杂交分析  55-59
      2.2.20.1 转基因植株siRNA/miRNA 的提取  55-56
      2.2.20.2 siRNA/miRNA 电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳）  56-57
      2.2.20.3 siRNA/miRNA 转膜（电转膜）及固定  57-58
      2.2.20.4 siRNA/miRNA 探针的制备  58
      2.2.20.5 siRNA/miRNA 杂交  58-59
3 结果与分析  59-90
  3.1 靶向于马铃薯Y 病毒CP 基因不同区段的hpRNA 介导的病毒抗性  59-74
    3.1.1 hpRNAi 植物表达载体的构建  59-62
      3.1.1.1 PVY CP 不同区段正向和反向目的片段的获得  59-60
      3.1.1.2 正向目的片段与表达载体pROKⅡ的连接  60
      3.1.1.3 反向目的片段与重组中间载体的连接  60-62
    3.1.2 农杆菌介导的瞬时侵染验证hpRNAi 植物表达载体的有效性  62-65
      3.1.2.1 转化农杆菌EHA105 菌株  62-63
      3.1.2.2 瞬时表达靶向PVY CP 的siRNA 的检测  63-64
      3.1.2.3 Northern 杂交检测瞬时侵染时靶RNA 的积累  64-65
    3.1.3 转基因烟草的获得  65-66
    3.1.4 转基因烟草的检测  66-68
    3.1.5 转基因烟草的抗病性分析  68-71
    3.1.6 转基因烟草的Northern 杂交分析  71-73
    3.1.7 转基因烟草植株中siRNA 的杂交分析  73-74
    3.1.8 T2代转基因植株的抗病性分析  74
  3.2 人工的miRNA 介导的马铃薯Y 病毒抗性  74-90
    3.2.1 amiRNA 的筛选及引物设计  74-75
    3.2.2 拟南芥天然miRNA 前体的克隆  75-77
    3.2.3 靶向于PVY CP 基因不同区段的人工miRNA 表达载体的构建  77
    3.2.4 重组表达载体的鉴定  77-78
    3.2.5 农杆菌介导的瞬时侵染检测amiRNA 表达载体的有效性  78-80
      3.2.5.1 转化农杆菌EHA105 菌株  78-79
      3.2.5.2 瞬时表达靶向PVY CP 的amiRNA 的检测  79-80
      3.2.5.3 Northern 杂交检测靶RNA 的积累  80
    3.2.6 转基因烟草的获得  80-81
    3.2.7 转基因烟草的检测  81-83
    3.2.8 转基因植株的抗病性分析  83-86
    3.2.9 转基因烟草的Northern 杂交分析  86-87
    3.2.10 转基因烟草植株中amiRNA 的杂交分析  87-88
    3.2.11 T2代转基因植株的抗病性分析  88-90
4 讨论  90-98
5 结论  98-99
参考文献  99-115
致谢  115-116
攻读学位期间发表论文情况  116-117
博士学位论文内容简介及自评  117

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物病害及其防治 > 侵（传）染性病害 > 病毒
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