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番茄斑萎病毒（TSWV）dsRNA介导的分子免疫调控作用研究

作　者: 孙书娥
导　师: 张德咏；刘勇
学　校: 中南大学
专　业: 植物病理学
关键词: 番茄斑萎病毒 RNA沉默 反向重复 双链RNA N基因
分类号: S436.412
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


番茄斑萎病毒(TSWV)是布尼亚病毒科(Bunuyaviridae)唯一侵染植物的番茄斑萎病毒属(Tospovirus)的病毒之一。分布于世界各地,对许多作物及植物造成巨大经济损失,加之难以防治。所以本研究主要从dsRNA介导的分子免疫调控方面来研究防治该病毒的方法。根据已报道的TSWV基因序列,设计通用引物,通过RT-PCR扩增了TSWV N基因和GN/GC基因的全长序列,并分别克隆到pGEM-T载体上,经PCR筛选和酶切鉴定与预期结果一致,对TSWVN基因和GN/GC基因进行测序,经过与GeneBank所登录的其他株系比对后,结果表明,N基因核苷酸序列与来自South Korea的三个株系的N基因核苷酸序列的一致率最高,达99%；GN／GC基因核苷酸序列与来自Spain的两个株系的GN/GC基因核苷酸序列一致率也高达99%。这说明：本研究中的材料在侵染寄主植物时发生了基因组重组的现象。根据克隆得到的TSWV N基因的序列,设计新的引物,引入需要的限制性内切酶酶切位点(AscI, SwaI, BamHI, SpeI),分别扩增313bp和536bp的片段。用于构建反向重复片段的植物表达载体。扩增N基因反向片段的引物时,在5’端引入限制性酶切位点SpeI,在3’端引入限制性酶切位点BamHI,扩增N基因正向片段时,在5’端引入限制性酶切位点AscI,在3’端引入限制性酶切位点SwaI,以中间载体pFGC1008自身的一段序列为内含子,构建反向重复dsRNA的载体,以pCAMBIA1304为构建反向重复dsRNA的植物表达载体,通过PCR、酶切、测序等方法验证,均表明构建的重组载体与预期相同。利用农杆菌介导法将构建好的反向重复dsRNA植物表达载体转化烟草,转化结果有待进一步分析鉴定。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-11
第一章 文献综述  11-25
  1 番茄斑萎病毒概述  11-15
    1.1 番茄斑萎病毒的分类地位、病原形态及生物学  11-12
      1.1.1 番茄斑萎病毒的分类地位  11
      1.1.2 番茄斑萎病毒的病原形态及生物学  11-12
    1.2 番茄斑萎病毒的分布及危害症状  12-15
      1.2.1 番茄斑萎病毒的分布  12-13
        1.2.1.1 国内研究现状及进展  13
        1.2.1.2 国外研究现状及进展  13
      1.2.2 番茄斑萎病毒的危害症状  13-15
    1.3 番茄斑萎病毒的传毒介体  15
  2 番茄斑萎病毒病的防治  15-16
  3 RNA沉默概述  16-23
    3.1 RNA沉默的定义  16-17
    3.2 RNA沉默的分类  17
    3.3 RNA沉默的发现  17-18
    3.4 RNA沉默的机制  18-20
      3.4.1 植物RNA沉默的主要途径  18-20
        3.4.1.1 siRNA途径  19
        3.4.1.2 miRNA途径  19-20
    3.5 RNA沉默的病毒抑制子  20-21
    3.6 RNA沉默的应用  21-23
      3.6.1 RNA沉默防治植物病毒病  21-22
      3.6.2 疾病治疗上的研究  22-23
      3.6.3 RNA沉默在作物品质改良中的应用  23
  4 本研究的意义目的  23-25
第二章 常用分子生物学方法及番茄斑萎病毒的检测  25-47
  1 材料  25-26
    1.1 菌株、质粒  25
    1.2 酶、化学试剂  25
    1.3 引物  25
    1.4 抗生素  25-26
    1.5 常用试剂的配制  26
  2 方法  26-36
    2.1 番茄斑萎病毒的接种与纯化  26
      2.1.1 番茄斑萎病毒的接种  26
      2.1.2 接种后的纯化  26
    2.2 DNA分子操作常规技术  26-35
      2.2.1 RT-PCR反应  26-27
        2.2.1.1 病毒RNA的提取  26-27
        2.2.1.2 cDNA的合成  27
        2.2.1.3 一般PCR反应  27
      2.2.2 DNA的纯化回收  27-29
        2.2.2.1 PCR产物试剂盒纯化回收  27-28
        2.2.2.2 DNA的割胶回收  28-29
      2.2.3 DNA的酶切体系  29
      2.2.4 DNA的连接  29-30
        2.2.4.1 PCR产物的连接  29-30
        2.2.4.2 酶切片段与载体的连接  30
      2.2.5 感受态细胞的制备方法  30-31
        2.2.5.1 制备感受态细胞的RbCl方法  30
        2.2.5.2 制备感受态细胞的Hanahan方法  30-31
      2.2.6 连接产物转化大肠杆菌  31-32
      2.2.7 重组质粒的筛选与鉴定  32-35
        2.2.7.1 重组质粒的PCR筛选  32
        2.2.7.2 碱裂解法提取质粒  32-33
        2.2.7.3 试剂盒提取质粒  33-34
        2.2.7.4 质粒的纯化与浓缩  34
        2.2.7.5 重组质粒的PCR鉴定  34
        2.2.7.6 重组质粒酶切鉴定  34
        2.2.7.7 重组质粒测序鉴定  34-35
      2.2.8 电泳  35
        2.2.8.1 EB电泳  35
        2.2.8.2 SYBR GreenI电泳  35
    2.3 血清学检测TSWV  35-36
      2.3.1 双抗体夹心法  35-36
      2.3.2 三抗体夹心法  36
  3 结果与分析  36-46
    3.1 病毒汁液摩擦接种  36-37
    3.2 TSWV N基因和G_N/G_C基因克隆与分析结果  37-46
      3.2.1 RT-PCR结果  37-42
      3.2.2 序列分析结果  42-46
  4 讨论  46-47
第三章 番茄斑萎病毒(TSWV)外壳蛋白N基因的克隆及dsRNA植物载体的构建  47-64
  1 N基因片段的克隆  47
  2 dsRNA植物表达载体的构建  47-50
    2.1 313bp dsRNA植物表达载体的构建  47-48
    2.2 536bp dsRNA植物表达载体的构建  48-50
  3 结果与分析  50-62
    3.1 N基因313bp片段的获得和反向重复植物表达载体的构建  50-56
      3.1.1 N基因313bp片段的获得  50-53
      3.1.2 N基因313bp反向重复表达载体的克隆  53-56
    3.2 N基因536bp片段的获得和反向重复植物表达载体的构建  56-62
      3.2.1 N基因536bp片段的获得  56-59
      3.2.2 N基因536bp反向重复表达载体的克隆  59-62
  4 讨论  62-64
    4.1 中间序列的使用和选择  62
    4.2 反向重复原核表达载体构建  62-63
    4.3 前景和意义  63-64
第四章 反向重复表达载体在烟草中的表达  64-67
  1 材料  64
    1.1 菌株和载体  64
    1.2 植物材料  64
    1.3 植物培养基  64
    1.4 试剂  64
  2 方法  64-66
    2.1 用于转化的根癌农杆菌的准备  64-65
      2.1.1 农杆菌LBA4404的感受态的制备  64
      2.1.2 电击转化农杆菌LBA4404  64-65
    2.2 烟草遗传转化体系的建立  65-66
      2.2.1 烟草N.benthamiana无菌苗的获得  65
      2.2.2 菌株的活化  65
      2.2.3 叶片的准备  65
      2.2.4 浸染  65
      2.2.5 共培养  65-66
      2.2.6 脱菌及选择培养  66
      2.2.7 生根培养  66
      2.2.8 组培苗的炼苗和移栽  66
  3 结果与分析  66-67
    3.1 卡那霉素临界值的筛选结果  66
    3.2 转基因烟草再生苗的获得  66-67
参考文献  67-73
附录A 本论文所用重要缩写词及中文对照  73-75
附录B 常用缓冲液及培养基配方  75-80
附录C 常用的抗生素及使用浓度  80
附录D 常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器  80-82
附录E TSWV N基因测序结果  82
附录F TSWV G_N/G_C基因测序结果  82-84
致谢  84-85
个人简介  85

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 蔬菜病虫害 > 茄果类病虫害 > 番茄病虫害
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