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沙棘弗兰克氏和非弗兰克氏放线菌的分离、培养及分子鉴定

作　者: 徐瑞瑞
导　师: 张建国
学　校: 中国林业科学研究院
专　业: 森林培育
关键词: 沙棘根瘤弗兰克氏菌非弗兰克氏放线菌系统发育
分类号: S718.81
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

沙棘(Hippophae rhamnoides L.)属胡颓子科沙棘属植物,是我国北方半干旱地区的先锋树种,因其能与弗兰克氏菌(Frankia)共生在根部形成固氮根瘤,能将大气中分子态的氮还原成氨供植物吸收利用,能在瘠薄土壤和较恶劣的环境中生长,是改良土壤、治理水土流失、改善生态环境的优良生态经济型树种。并且,沙棘的果、叶和种子中含有大量的营养成分和对人体有重要意义的生物活性物质。为了更好的开发利用沙棘共生固氮特性,本论文对沙棘根瘤弗兰克氏菌的分离培养条件及其系统发育地位进行了初步的研究,主要的实验结果如下:(1)沙棘根瘤弗兰克氏菌的系统发育地位。采集不同生态环境不同沙棘品种的根瘤,从根瘤内直接扩增DNA,共得到39条根瘤内生菌的16SrDNA序列,属于20个单倍型,其中磴口沙棘根瘤内生菌的16SrDNA序列有19条,属于4个单倍型,孙吴的根瘤内生菌的16SrDNA序列有20条,属于16个单倍型,两个地区间的根瘤内生菌没有共享的单倍型,不存在基因交流。基于基因库中下载的和沙棘根瘤扩增的16SrDNA序列构建系统发育树,将不同地域、不同宿主来源的弗兰克氏菌分为4个明显的分支,包括胡颓子侵染组、杨梅-木麻黄-赤杨侵染组、非典型菌株和未获得纯培养的根瘤弗兰克氏菌组。其中来自沙棘根瘤的内生菌以52%的支持率全部聚在了胡颓子侵染组,均属于弗兰克氏菌。(2)沙棘根瘤内生菌的分离、培养。实验选取新鲜幼嫩的沙棘根瘤,采用BAP培养基和QMOD培养基,经根瘤匀浆法和切片法从表面消毒的根瘤中分离根瘤内生菌,经纯化得到18个纯培养菌株,其中通过切片法分离到14株,匀浆法得到4株。研究发现,根瘤切片法、BAP培养基及液体培养的方式更适合沙棘根瘤内生菌的分离,液体培养能有效的分离菌株,菌落出现时间比固体分离早7-10天左右。(3)沙棘根瘤纯培养菌株的形态特征和分子鉴定。从沙棘根瘤中分离的18株纯培养菌株除了JYY61、JYY62,其余都具有发达的气生菌丝,在显微镜下所有菌株都有分支状的菌丝,但没有弗兰克氏菌典型的泡囊及孢子囊结构,均不属于弗兰克氏放线菌。根据基内菌丝和气生菌丝发育情况、菌丝与培养基结合程度、液体培养是否产生菌膜以及菌丝有无隔膜、孢子分化等形态培养特征,将来自沙棘根瘤的18个菌株分为两类,并初步判定第一类菌株属于诺卡氏菌属(Nocardia),第二类菌株属于小单孢菌属(Micromonospora)。基于网上下载和实验得到的16SrDNA基因序列构建的系统发育树(NJ树和MP树),18株非弗兰克氏放线菌被分为明显的两个分支,分别属于诺卡氏菌属分支和小单孢菌属分支,16SrDNA基因序列分析的系统分类结果支持基于菌株形态培养特征划分的两个类群。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-15
第一章绪论  15-35
  1.1 引言  15-16
    1.1.1 研究背景  15-16
    1.1.2 研究目的  16
    1.1.3 项目来源与经费支持  16
  1.2 弗兰克氏菌的分类研究  16-26
    1.2.1 弗兰克氏菌共生固氮体系的研究历史  17-18
    1.2.2 弗兰克氏菌的分类研究进展和方法探索  18-26
  1.3 非弗兰克氏放线菌研究进展  26-31
    1.3.1 非弗兰克氏放线菌寄居位置与形态特征  27-28
    1.3.2 非弗兰克氏放线菌与寄主植物的关系  28-29
    1.3.3 非弗兰克氏放线菌的固氮能力  29
    1.3.4 非弗兰克氏放线菌的系统分类地位  29-31
  1.4 研究展望  31-32
    1.4.1 弗兰克氏菌研究展望  31
    1.4.2 非弗兰克氏放线菌研究展望  31-32
  1.5 研究目标和主要研究内容  32-35
    1.5.1 研究目标  32-33
    1.5.2 主要研究内容  33-34
    1.5.3 研究技术路线  34-35
第二章沙棘根瘤弗兰克氏菌的系统发育分析  35-56
  2.1 材料与方法  35-43
    2.1.1 研究区概况  35-36
    2.1.2 宿主植物概况  36
    2.1.3 根瘤采集  36-38
    2.1.4 主要的仪器设备  38-39
    2.1.5 常规实验试剂及配制  39-40
    2.1.6 生化及分子生物学试剂  40
    2.1.7 根瘤总DNA 的提取  40
    2.1.8 引物设计及内切酶NruⅠ体系  40-41
    2.1.9 PCR 扩增及电泳观察  41-42
    2.1.10 NCBI 序列下载  42
    2.1.11 序列数据分析方法  42-43
  2.2 结果  43-50
    2.2.1 DNA 提取  43
    2.2.2 沙棘根瘤内生菌PCR 产物检测  43-44
    2.2.3 沙棘根瘤内生菌的16SrDNA 序列分析结果  44-46
    2.2.4 NCBI 下载与实验所得的16SrDNA 基因序列比较分析  46-50
  2.3 本章小结  50-56
    2.3.1 NruⅠ限制性内切酶酶切植物细胞中叶绿体的16SrDNA  50
    2.3.2 磴口沙棘根瘤内生菌的多样性高于孙吴县沙棘根瘤内生菌  50-51
    2.3.3 沙棘根瘤内生菌的分子鉴定  51
    2.3.4 沙棘根瘤中可以直接扩增到弗兰克氏菌的16SrDNA 序列  51-52
    2.3.5 弗兰克氏菌的分类  52-56
第三章沙棘根瘤非弗兰克氏放线菌分离培养与形态特征  56-75
  3.1 材料与方法  56-60
    3.1.1 研究区概况  56-57
    3.1.2 宿主植物概况  57
    3.1.3 根瘤采集  57
    3.1.4 主要仪器设备  57
    3.1.5 分离培养基  57-59
    3.1.6 分离方法  59-60
    3.1.7 根瘤内生菌的形态特征观察  60
  3.2 结果  60-72
    3.2.1 沙棘根系结瘤情况  60-61
    3.2.2 沙棘根瘤内生菌的分离  61
    3.2.3 沙棘根瘤内生菌的形态培养特征  61-72
  3.3 本章小结  72-75
    3.3.1 沙棘根系结瘤特点  72-73
    3.3.2 沙棘根瘤内生菌的分离  73
    3.3.3 沙棘根瘤内生菌的初步判定  73-75
第四章沙棘根瘤非弗兰克氏放线菌的分子鉴定和系统发育分析  75-91
  4.1 材料与方法  75-78
    4.1.1 主要的仪器设备  75
    4.1.2 常规实验试剂及配制  75
    4.1.3 生化及分子生物学试剂  75
    4.1.4 实验菌株来源  75-76
    4.1.5 菌株总DNA 的提取  76
    4.1.6 引物设计与合成  76
    4.1.7 PCR 扩增及电泳观察  76-77
    4.1.8 NCBI 序列下载  77-78
    4.1.9 序列数据分析方法  78
  4.2 结果  78-89
    4.2.1 沙棘根瘤非弗兰克氏放线菌PCR 产物检测  78-79
    4.2.2 沙棘根瘤非弗兰克氏放线菌的16SrDNA 序列分析结果  79-81
    4.2.3 NCBI 下载与实验所得到的16SrDNA 基因序列分析  81-89
  4.3 本章小结  89-91
    4.3.1 沙棘根瘤非弗兰克氏菌的分子鉴定  89
    4.3.2 沙棘根瘤非弗兰克氏菌可能具有的特性  89-91
第五章结论与讨论  91-96
  5.1 结论  91-92
    5.1.1 沙棘根瘤弗兰克氏菌的系统发育地位  91
    5.1.2 沙棘根瘤非弗兰克氏放线菌的分离培养  91
    5.1.3 沙棘根瘤非弗兰克氏放线菌的形态特征分类及分子鉴定  91-92
  5.2 讨论  92-96
    5.2.1 弗兰克氏菌的分离体系  92
    5.2.2 直接从根瘤中扩增16SrDNA 的技术  92-93
    5.2.3 弗兰克氏菌与寄主植物的协同进化关系  93
    5.2.4 沙棘根瘤非弗兰克氏放线菌的可能特性  93-94
    5.2.5 本研究中存在的问题  94
    5.2.6 展望  94-96
参考文献  96-108
在读期间的学术研究  108-109
致谢  109

沙棘弗兰克氏和非弗兰克氏放线菌的分离、培养及分子鉴定

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