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青砖茶中的真菌及其散囊菌黄色素的研究

作　者: 王波
导　师: 于汉寿
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 青砖茶分类散囊菌系统发育黄色素
分类号: TS272
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

青砖茶是砖茶中重要的一大类茶,在我国内地不常见,主要供应边疆少数民族饮用。关于砖茶中的微生物研究较多的是茯砖茶,而对青砖茶、康砖茶等砖茶及其中微生物的研究很少。本文开展了对青砖茶中微生物种类及数量的调查以及其中主要真菌对其品质和风味影响和散囊菌黄色素的研究,主要研究内容和结果如下：1、2007年1月,利用稀释平板法对青砖茶原料、不同制作阶段茶样和成品茶共二十个材料中的微生物进行分离,调查整个青砖茶加工阶段真菌的种类及其各种微生物数量变化的规律。渥堆过程中微生物的种类和数量最多,渥堆前后分别存在增加和减少的过程。共分离到真菌156株,占70.58%；酵母14株,占6.33%；细菌30株,占13.57%；放线菌21株,占9.50%。表明青砖茶中的微生物以丝状真菌占优势,细菌次之,放线菌第三,酵母最低。鉴于在青砖茶微生物的调查过程中,无论从种类和数量上,真菌都是最多的,因此本研究重点对茶样中的真菌菌株进行纯化、培养和鉴定。2、经典分类法仍然是被广泛用来鉴定真菌的主要方法。为了解青砖茶加工过程中存在的主要真菌种类和后续研究,本研究主要对这156株真菌分离菌株的形态学特征进行调查,包括菌落特征和产孢结构等特征的观察。结果表明,青砖茶加工过程中存在曲霉属、青霉属和散囊菌属等近10个属的真菌。在丝状真菌的调查中,曲霉属真菌的分离频率最高；其次是青霉属真菌；曲霉中尤以黑曲霉(Aspergillus niger)分离频率最高,为57.8%；其次是灰绿曲霉(A. glaucus),分离频率为17.02%。3、对相关基因序列进行系统发育学分析是近年来真菌分类鉴定的重要依据。本研究以分离自不同年代、不同产地的茯砖、康砖和青砖茶中的散囊菌(Eurotium spp.)以及5个标准菌株共计16个Eurotium属菌株为材料,对它们的tubB和ITS序列进行克隆测序,并结合该属内所有已经建立的种进行系统发育学分析。结果表明：分离自我国砖茶中的散囊菌菌株间的tubB和ITS序列相似度很高；由tubB和ITS序列构建的系统发育树表明,分离自青砖茶成品中的Qa-30406-1,形态学和分子水平的鉴定结果均证实为E. cristatum。分离自茯砖茶中的Fa-20719-3、F4-20608-1、F5-20608-1、F2-20608-2和F3-20608-2均鉴定为E. cristatum,除了分离自康砖茶中的K8-30721-6为E. chevalieri,其它分离自康砖茶中的菌株也为E. cristatum。4、为进一步了解青砖茶中的真菌对其品质的影响,本研究通过人工接种从青砖茶中分离到的主要真菌(包括曲霉属、青霉属和散囊菌属)到青砖原料中,25℃培养一定时间,研究了不同菌株对茶样生化成分的影响。青砖原料接种真菌分离菌株后,与对照相比除了接种22F10 (Aspergillus sp.)菌株的茶样中茶多酚略有下降外,接种菌株35F06 (Penicilliumsp.)、AF09 (Eurotium cristatum)、21F06 (Aspergillus sp.)和35F03 (Penicillium sp.)的四个处理都有所增加；氨基酸含量与对照相比均减少,咖啡碱含量变化很少；以上结果表明青砖茶中的主要真菌分离菌株对青砖茶的品质和风味有一定的影响。5、为寻找优质黄色素生产资源,本研究以黄色的冠突散囊菌(Eurotium cristatum)为材料,利用有机溶剂辅助超声波等方法从固体平板和液体培养的菌丝体中均提取出黄色素,并研究了光、温度及一些化学成分对该色素稳定性的影响。采用有机溶剂辅助超声波等方法能成功提取出该色素；根据吸收光谱特征,初步推断该色素含有类胡萝卜素。并且该色素耐受灯光、室内散射光、不耐阳光和紫外光；耐酸,不耐碱；对温度敏感。供试的11种金属离子对该色素有不同程度的影响；磷酸的破坏性显著；H2O2、NaHSO3对该色素有较强的破坏；柠檬酸对该色素有一定的破坏作用；同等条件下,苯甲酸钠对该色素的破坏作用大于山梨酸钾；EDTA-Na2和Vc有一定的护色作用；糖类、NaCl、草酸和乳酸对该色素的稳定性几乎无影响。

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摘要 7-9ABSTRACT 9-11文献综述 11-33 1、青砖茶概况 11-13 1.1 青砖茶的由来 11-12 1.2 青砖茶的营养价值及保健功效 12 1.3 青砖茶的生产与传播 12-13 2、砖茶中微生物的研究 13-17 2.1 黑茶和砖茶中的微生物及其作用 14-15 2.2 砖茶渥堆中微生物的变化和作用 15-17 3、青砖茶中的微生物 17 4、微生物对茶品质和风味的影响 17-20 4.1 微生物代谢产物的研究 17-18 4.2 微生物对茶品质和风味的影响 18-19 4.3 微生物对砖茶品质和风味的影响 19-20 5、真菌分类鉴定最新趋势和发展方向 20-24 5.1 真菌分类概述 20-22 5.2 散囊菌(Eurotium spp.)的研究进展 22-23 5.3 散囊菌的分类鉴定 23-24 6、微生物色素的研究概况及其进展 24-27 6.1 黄色素提取方法研究进展 26-27 6.2 黄色素稳定性研究 27 7、本研究的主要目的和研究内容 27-28 参考文献 28-33第一章青砖茶中微生物的分离、培养及其数量的调查 33-45 1 材料和方法 34-36 1.1 供试茶样的来源与保存 34-35 1.2 茶样的处理 35 1.3 茶样中微生物的分离 35 1.4 分离菌株的纯化和保存 35-36 1.5 不同加工阶段茶样中真菌分离频率的调查 36 1.6 微生物种群数量的调查 36 2 结果与分析 36-43 2.1 茶样中真菌的分离和培养 36-39 2.2 茶样中"金花菌"的分离和培养 39 2.3 茶样中放线菌的分离和培养 39-40 2.4 茶样中细菌的分离和培养 40 2.5 微生物的数量及其区系分析 40-41 2.6 青砖茶中微生物种群数量的变化 41-43 3 讨论 43-44 参考文献 44-45第二章青砖茶中主要分离真菌的形态学特征 45-57 1 材料和方法 45-47 1.1 供试菌株的来源与保存 45-46 1.2 培养基 46 1.3 真菌的培养、鉴定 46 1.4 菌株产孢结构的观察 46-47 2 结果与分析 47-54 2.1 供试菌株的形态学特征 47-54 3 讨论 54-55 参考文献 55-57第三章散囊菌属真菌分离菌株的系统发育学分析 57-75 1 材料与方法 58-65 1.1 材料 58-59 1.2 菌株的培养 59 1.3 总DNA的提取 59-60 1.4 相关序列的PCR扩增 60-61 1.5 相关序列的克隆测序 61-64 1.5.1 PCR扩增产物的回收 61-62 1.5.2 目的DNA片段和载体的连接 62 1.5.3 感受态E.coil细胞的制备 62 1.5.4 载体质粒的转化 62-63 1.5.5 对单克隆提取质粒检测 63-64 1.5.6 目的DNA序列的测序 64 1.6 序列的分析 64-65 2 结果与分析 65-70 2.1 供试菌株的形态学特征的调查 65-67 2.2 总DNA的提取 67 2.3 目的基因的PCR扩增、PCR扩增产物的回收和克隆 67-69 2.4 序列比对和系统发育学分析 69-70 3 讨论 70-72 参考文献 72-75第四章青砖茶中主要真菌菌株对其品质的影响 75-83 1 材料和方法 75-79 1.1 供试材料 75-76 1.2 真菌分离菌株的接种 76 1.3 样品制备 76-77 1.4 茶样干物质含量的测定 77 1.5 茶多酚的测定 77 1.6 氨基酸的测定 77-78 1.7 咖啡碱的测定 78 1.8 黄酮苷的测定 78-79 2 结果与分析 79-80 2.1 供试茶样的部分生化成分含量 79-80 2.2 真菌分离菌株对青砖茶品质的影响 80 3 讨论 80-81 参考文献 81-83第五章散囊菌黄色素的提取及稳定性研究 83-95 1 材料与方法 83-85 1.1 供试菌株及主要培养基 83-84 1.2 主要仪器及试剂 84 1.3 色素的提取 84 1.4 色素丙酮提取液稳定性的测定 84-85 2 结果与分析 85-90 2.1 散囊菌产黄色素情况 85 2.2 色素的光谱吸收特征 85-86 2.3 浸提剂的筛选 86 2.4 提取方法的比较 86 2.5 理化因子对色素稳定性的影响 86-90 3 讨论 90-92 参考文献 92-95综合讨论 95-99参考文献 99-101全文总结 101-103致谢 103-105附录 105

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