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PI3K-Akt-mTOR信号通路参与调控细胞分化

作　者: 孟艳
导　师: 赵春华；张宏冰
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 内科学
关键词: PI3K mTOR 胰岛素信号通路 胰岛素受体底物 PDGFR Notch 分化
分类号: R329
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


PI3K-Akt-mTOR信号通路在生物体内众多细胞信号通路中占据相当重要的地位,参与调控如增殖、代谢、生长、分化、凋亡等多种生命现象,同时在炎症、肿瘤、代谢和心血管疾病的发病机制中起重要作用,对PI3K-Akt-mTOR通路的研究是目前生命科学研究领域的热点。本文的第一部分探讨mTOR信号通路与细胞分化之间的关系。细胞分化的异常可以引起多种疾病,肿瘤就是一种分化异常的疾病。而PI3K-Akt-mTOR通路涉及多个原癌基因和抑癌基因,该通路的异常活化在肿瘤中最为常见。实验结果表明,mTOR信号通路的过度活化对细胞分化起着阻碍的作用。同时研究结果表明,mTOR信号通路对于分化的影响是通过对Notch信号通路的调控来实现的。该调控过程涉及多个分子的参与,形成了mTOR—p63—Jagged-1—Notch的通路对分化进行调控。此项研究对于探讨肿瘤发生机制和治疗都有着重要的作用。本文的第二部分主要研究PI3K-Akt-mTOR信号通路对胰岛素信号通路的调控机制。实验结果表明,PI3K-Akt-mTOR信号通路中的重要受体PDGFR对胰岛素信号通路起着重要的调控作用。PDGFR对胰岛素信号通路的调控是通过对胰岛素通路下游分子胰岛素受体底物(insulin receptor substrates,IRS)的调控来实现的。本文的第三部分旨在比较PI3K-Akt-mTOR信号通路在间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)和脂肪前体细胞系3T3-L1的成脂肪分化过程中的作用。实验结果表明,在3T3-L1成脂肪分化过程中需要mTOR信号通路的激活,而且这个过程需要胰岛素的参与。而在MSCs的成脂肪分化过程中,mTOR信号通路却呈现下调趋势。因此,mTOR信号通路在这两种前体细胞中的作用是不同的,这是由上述两种细胞的本质和在生物体内所起的作用不同所决定的。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-8
第一部分 mTOR通过p63-Jagged-1上调Notch通路实现对分化的调控  8-58
  1 前言  8-11
  2 技术路线  11-13
  3 材料与方法  13-27
    3.1 实验材料  13-19
      3.1.1 细胞系和菌株  13
      3.1.2 引物和RNAi序列  13-14
      3.1.3 主要实验仪器  14-15
      3.1.4 细胞培养材料  15
      3.1.5 抗体  15
      3.1.6 酶及抑制剂  15-16
      3.1.7 药品、试剂及溶液配制  16-19
    3.2 主要实验方法  19-27
      3.2.1 细胞培养、复苏与冻存  19-20
      3.2.2 细胞中总RNA的提取  20
      3.2.3 RT-PCR二步法  20-21
      3.2.4 Realtime PCR  21
      3.2.5 siRNA靶序列的选择  21-22
      3.2.6 真核细胞转染—DNA和siRNA  22-24
      3.2.7 诱导分化  24
      3.2.8 Western Blot分析  24-27
  4 结果  27-46
    4.1 检测mTOR对细胞分化的作用  27-29
      4.1.1 成肌分化  27-29
      4.1.2 成脂分化  29
    4.2 mTOR高度活化对分化影响的机制  29-46
      4.2.1 mTOR高度活化激活Notch通路  30-31
      4.2.2 mTOR高度活化上调Notch配体Jagged-1的表达  31
      4.2.3 mTOR高度活化激活p63  31-32
      4.2.4 p63调控Notch配体Jagged-1的表达  32
      4.2.5 P63-Jagged1-Notch通路的激活依赖于mTOR  32
      4.2.6 下调p63促进mTOR活化细胞分化  32-33
      4.2.7 mTOR激活p63-Jagged1-Notch通路的机制  33-46
  5 讨论  46-49
  参考文献  49-58
第二部分 PDGF受体通过IRS-1调控胰岛素信号通路  58-79
  1 前言  58-60
  2 技术路线  60-61
  3 材料与方法  61-63
    3.1 实验材料  61-62
      3.1.1 细胞系、菌株和载体  61
      3.1.2 引物  61
      3.1.3 抗体  61-62
    3.2 主要实验方法  62-63
  4 结果  63-71
    4.1 PDGF受体对胰岛素受体底物的表达起重要的调节作用  63
    4.2 PDGF受体缺失导致细胞呈现出胰岛素抵抗  63
    4.3 IRS恢复PDGF受体缺失细胞的胰岛素反应  63-64
    4.4 PDGF受体上调TSC缺失细胞中IRS的表达  64
    4.5 PDGF受体恢复TSC缺失细胞的胰岛素反应  64-65
    4.6 PDGF受体对IRS调控的机制  65-71
      4.6.1 mRNA水平  65
      4.6.2 蛋白降解水平  65-71
  5 讨论  71-73
  参考文献  73-79
第三部分 间充质干细胞的成脂分化不依赖胰岛素及mTOR的上调  79-98
  1 前言  79-81
  2 技术路线  81-82
  3 材料与方法  82-85
    3.1 实验材料  82-83
      3.1.1 细胞系  82
      3.1.2 细胞培养材料  82
      3.1.3 抗体  82-83
    3.2 主要实验方法  83-85
      3.2.1 成人脂肪间充质干细胞的分离培养  83
      3.2.2 成人脂肪间充质干细胞的接种和扩增培养  83
      3.2.3 流式细胞仪鉴定细胞的表型  83-84
      3.2.4 流式细胞术分析细胞周期分布  84
      3.2.5 成脂诱导  84
      3.2.6 Western Blot分析  84-85
  4 结果  85-92
    4.1 间充质干细胞成脂分化过程不需要胰岛素  85-86
      4.1.1 体外培养脂肪来源MSCs的生物学性状  85
      4.1.2 MSCs的成脂分化不需要胰岛素的参与  85
      4.1.3 MSCs成脂分化过程中mTOR信号呈下调状态  85-86
    4.2 MSCs的成脂分化过程需要mTOR信号通路的活性  86
    4.3 MSCs的成脂分化过程中PDGFR的表达上调  86-92
  5 讨论  92-93
  参考文献  93-98
结论  98-101
综述 mTOR信号通路在细胞分化和肿瘤发生中的作用  101-117
  1 mTOR信号通路  101-104
    1.1 上游分子  101-103
      1.1.1 PI3K  101-102
      1.1.2 Akt  102
      1.1.3 PTEN  102
      1.1.4 TSC1/2  102-103
      1.1.5 mTOR  103
    1.2 下游分子  103-104
      1.2.1 S6K和4EBP  103-104
  2 PI3K-Akt-mTOR信号通路在细胞分化中的作用  104-106
    2.1 PI3K-Akt-mTOR信号通路在胚胎干细胞分化中的作用  104
    2.2 PI3K-Akt-mTOR信号通路在成体干细胞分化中的作用  104-106
      2.2.1 PI3K-Akt-mTOR信号通路与脂肪细胞分化  104-105
      2.2.2 PI3K-Akt-mTOR信号通路与成骨分化  105
      2.2.3 PI3K-Akt-mTOR信号通路与平滑肌的分化  105
      2.2.4 PI3K-Akt-mTOR信号通路与内皮分化  105-106
      2.2.5 PI3K-Akt-mTOR信号通路与上皮细胞的分化  106
  3 PI3K-Akt-mTOR信号传递通路在肿瘤形成中的作用  106-108
  4 结语  108
  参考文献  108-117
缩略语表  117-119
附录  119-120
致谢  120-121

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