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棉铃虫蛹滞育解除相关基因的克隆、表达和功能研究

作　者: 杨靖
导　师: 徐卫华
学　校: 中山大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 棉铃虫滞育解除细胞色素氧化酶亚基1 ndua6 Vo-ATPase亚基e
分类号: S433
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

滞育是指昆虫个体接收到环境信号后,程序性地在不良环境到来之前进入一种低代谢、低速发育甚至不发育的状态。对昆虫滞育的研究不但有助于我们了解昆虫的抗逆性,为害虫防治提供新思路,而且昆虫滞育本身也是研究动物发育调节的一个理想模型。根据不同发育阶段,昆虫的滞育可分为卵滞育、蛹滞育、幼虫滞育和成虫滞育。目前的研究结果认为不同的滞育形态分别由不同的作用机制调节的。棉铃虫Helicoverpa armiger(aHar)属鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)昆虫,是我国主要的农业害虫,以蛹的形式滞育。蛹滞育的经典理论认为是由于脑中促前胸腺激素(PTTH)合成的下调或者是释放受阻,导致前胸腺合成促进发育的蜕皮激素减少,最后进入滞育。蛹滞育解除时,血淋巴中PTTH滴度上升,促进前胸腺分泌蜕皮激素,使发育进程重新启动。通过给棉铃虫活体注射重组PTTH打破蛹滞育直接证明了PTTH→蜕皮激素→滞育解除这条通路。滞育激素(DH)是从家蚕促咽下神经节中分离得到的一种昆虫神经肽,能诱导家蚕卵滞育。有趣的是,DH不能诱导棉铃虫滞育,反而能打破棉铃虫蛹滞育。实验证明,DH打破滞育也是通过作用于前胸腺产生蜕皮激素这一路径。所以鉴定应答蜕皮激素的相关基因对查明滞育解除的机理是至关重要的工作。为此我们用差异展示方法(DD-PCR)对棉铃虫蛹滞育打破相关基因进行了筛选,结果得到30个有差异的cDNA片段;通过RT-PCR验证,得到三个与蛹滞育打破相关的基因。同源比较显示它们分别与番茄褐夜蛾Feltia jaculifera细胞色素氧化酶亚基1(90%)、库蚊Culex pipiens NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex subunit 6(ndua6)(70%)、烟草天蛾Manduca sexta V0-ATPase subunit e (92%)有较高的相似性。三个基因全长序列分别为1530 bp、567 bp和525 bp,阅读框编码510、125和85个氨基酸的蛋白。细胞色素氧化酶亚基1(Cytochrome c oxidase subunit 1, COX1)是线粒体电子传递链的末端酶COX的第一个亚基,由线粒体基因组编码,它与另外两个线粒体基因组编码的亚基COX2和COX3共同组成COX活性中心。我们获得cox1的cDNA全长,其ORF包含1530核苷酸,编码510个氨基酸,起始密码子为CGA。为弄清棉铃虫在蛹期及滞育解除时对不同能量要求的反应,我们对cox1 mRNA、蛋白水平表达、COX活性及磷酸化进行了调查。结果显示:棉铃虫cox1 mRNA和蛋白水平的表达与COX活性相关;非滞育蛹COX活性高,而滞育蛹则保持低能量代谢水平。注射20-羟基蜕皮酮打破棉铃虫蛹滞育时,cox1 mRNA及蛋白水平表达逐渐增加的同时COX活性显著提高。棉铃虫COX1的酪氨酸磷酸化与COX活性密切相关,暗示可逆蛋白磷酸化可能通过调节能量代谢的速率在昆虫滞育中起关键作用。NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex subunit 6 (ndua6)是线粒体电子传递链第一个酶复合物的一个附着小蛋白,由核基因编码。棉铃虫脑中ndua6基因mRNA和蛋白水平表达非滞育蛹显著高于滞育型蛹。滞育型蛹ndua6 mRNA水平表达在蛹早-中期(0-10天)和滞育维持期(10-35天)没有明显差异,蛋白表达略有下调。注射20-羟基蜕皮酮打破蛹滞育,1天时ndua6 mRNA及蛋白表达水平均上调,2-3天时,蛋白表达仍然保持高水平,而mRNA转录在2天时下调,第3天时又回调至第1天水平,表现出波动性。V0-ATPase亚基e是液泡膜上ATP水解酶的一个亚基,是一个二次跨膜蛋白。在滞育蛹脑中,V-ATPase亚基e在滞育前期及维持期都稳定表达,表达量低于非滞育蛹,注射蜕皮激素24小时后,快速上调。非滞育蛹ATPase活性高于滞育蛹,前期高,然后逐步下降。滞育蛹ATPase活性与COX活性趋势基本一致,始终维持在低水平,只是在20-羟基蜕皮酮打破滞育后会显著增高。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-9
第一部分前言  9-25
  1 昆虫滞育解除研究进展  9-14
  2 昆虫滞育能量代谢研究进展  14-16
  3 V-ATPase研究进展  16-19
  4 差异展示技术及其在昆虫研究中的应用  19-23
  5 研究背景、意义和技术路线  23-25
第二部分材料与方法  25-33
  2.1 棉铃虫的饲养  25
  2.2 总 RNA 的抽提  25
  2.3 反转录合成 cDNA 第一链  25
  2.4 差异展示PCR  25-27
  2.5 RACE  27-28
  2.6 质粒DNA 的小量抽提  28
  2.7 感受态细胞的制备和连接转化  28-29
  2.8 DNA 电泳和DNA 胶回收  29
  2.9 NDUA6 的表达、纯化与抗体制备  29-30
  2.10 Western blot  30-31
  2.11 COX1 的磷酸化分析  31
  2.12 COX 酶活分析  31-32
  2.13 ATPase 活性分析  32-33
第三部分结果与分析  33-60
  3.1 差异展示筛选滞育打破相关基因  33-35
  3.2 细胞色素氧化酶亚基 1 的 cDNA 结构与功能分析  35-51
  3.3 棉铃虫 ndua6 的 cDNA 结构与功能分析  51-55
  3.4 Vo-ATPase 亚基 e 的结构与功能分析  55-60
第四部分讨论  60-65
  4.1 细胞色素氧化酶在棉铃虫蛹滞育中的作用  60-63
  4.2 NDUA6 在棉铃虫滞育及滞育打破中的作用  63
  4.3 V0-ATPase 亚基 e 在棉铃虫滞育及滞育打破中的作用  63-65
参考文献  65-72
缩略词  72-73
攻读博士学位期间发表的论文  73-74
致谢  74

棉铃虫蛹滞育解除相关基因的克隆、表达和功能研究

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