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猪的转腺苷一磷酸脱氨酶1基因细胞系的制备

作　者: 徐兴超
导　师: 刘娣；张冬杰
学　校: 东北农业大学
专　业: 养殖
关键词: 猪 AMPD1 成纤维细胞 PK15细胞转染
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

腺苷一磷酸脱氨酶(Adenosine monophosphate deaminase,AMPD)是嘌呤代谢过程中一种关键的酶。只在真核生物中发现的一种酶,由多基因家族编码。该基因的活化可保护肌细胞免受能量缺乏,其功能缺失会导致一种代谢性肌肉疾病。本研究通过对猪 AMPD1基因改变其表达和功能,达到改进猪肌肉质量和风味的可能目的。本实验以Genbank里猪的AMPD1基因序列为基础,采用PCR方法克隆了民猪AMPD1基因的cDNA序列;采用双酶切与过夜连接的方法将AMPD1基因的完整编码区片断连入pcDNA3.1(+)真核表达载体;采用常规方法对猪的胎儿成纤维细胞和PK15细胞进行培养,设计了4组不同的转染体系,即质粒:脂质体=1:2/1:3/2:5/2:7,转染结束后对其转染效率进行比对分析;采用脂质体法将构建好的质粒分别转入成纤维细胞和PK15细胞,转染后选择在6天致死细胞的G418浓度作为转染细胞所用最适的药物筛选浓度,14天致死细胞的G418浓度作为筛选后的维持浓度,最后用PCR法鉴定所得阳性转基因细胞株。本实验主要研究结果如下:1)成功克隆了民猪AMPD1基因的完整编码区2207个bp序列。2)经双酶切鉴定后成功构建了猪的AMPD1基因真核表达载体pcDNA3.1-AMPD1。3)针对pcDNA3.1-AMPD1质粒成纤维细胞中的最佳转染条件为200μg/mlG418筛选浓度,100μg/ml维持浓度;在PK15细胞中的最佳转染条件为1000μg/ml G418筛选浓度,500μg/ml维持浓度。在两种细胞内质粒:脂质体均为2:5,稳定转染6h后转染效果最佳。4)在稳定表达猪AMPD1基因的成纤维细胞和PK15细胞中均扩增出目的基因,表明转染成功。5)获得了稳定整合AMPD1基因的PK15细胞单克隆。

猪的转腺苷一磷酸脱氨酶1基因细胞系的制备

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