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类风湿性关节炎动物模型制备与发病机理的探讨

作　者: 王贵霞
导　师: 张秀英
学　校: 东北农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 类风湿性关节炎 动物模型 软骨细胞 IL-17 ADAMTS-4
分类号: S856
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
下　载: 617次
引　用: 2次
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内容摘要


类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜炎、破坏性关节病变为主要特征的慢性、自身免疫性疾病,致畸、致残率极高。对于RA至今尚无特效疗法,东北农业大学生命科学学院生物制药教研室正在研发的治疗RA的重组基因工程抗体药物,是以抗引起RA主要致炎因子IL-1β,IL-17为靶标的双价抗体药物,它的研制成功将填补国内治疗RA疾病的双价抗体药物的空白,缩短我国生物制药与世界总体制药水平的差距。为了保证生物技术药物的安全,有效和质量监控,需要进行临床前药理学的研究,动物模型的构建则是其中最为重要的组成环节之一,本研究的首要目的是建立能较全面反映RA特点的动物疾病模型。IL-1β在RA炎的发病进程中的主要作用机理已经得到了明确的阐述,主要是使滑膜细胞和软骨细胞合成和释放胶原酶和其他蛋白溶解酶,并抑制软骨细胞合成蛋白多糖基质,从而在RA炎的发病进程中起重要作用;而近年来在RA病人滑膜上清液中发现大量存在的具有生物活性的IL-17,能显著促进炎症细胞分泌TNF-α、IL-1β,与其他炎症细胞因子有协同作用,间接促进RA炎症的发展。而多聚蛋白聚糖酶,即带有血小板凝血酶原敏感基序的解整连素和金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS) ADAMTS-4对RA疾病中细胞外基质蛋白聚糖的降解起着重要的作用。在构建动物模型的基础上,本研究将通过IL-17诱导体外培养的软骨细胞,检测ADAMTS-4的表达情况,深入的研究IL-17在RA疾病中的是否在关节局部发挥直接作用,以期进一步探讨RA在分子水平的发病机理,更好的为创新药物的临床前药理学研究提供基础。首先建立类风湿性关节炎动物模型,方法为:45只SD大鼠随机分成3组:免疫诱导组,免疫诱导加寒湿刺激组和对照组。免疫诱导组用鸡Ⅱ型胶原和弗氏完全佐剂乳化混合后0.25mL注入大鼠足跖部和背部皮下,7d后以0.1mL乳化剂加强免疫一次。寒湿刺激组在免疫诱导的基础上,每天将大鼠放入冰水中1h,连续14d。以相同体积的溶剂冰醋酸注射做为对照组。诱导后每周测量大鼠体重和足爪肿胀程度,21d和42d分别采集大鼠血清,测定抗Ⅱ型胶原抗体、TNF-α、IL-1β和IL-17表达水平,并对踝关节进行组织病理学、X-ray放射学检查。成功建立RA的整体动物模型后,本研究进一步采用体外试验研究法,从分子水平单因素的考察IL-17在关节局部的致病作用,首先以胰蛋白酶和胶原酶两步消化法无菌取得大鼠软骨细胞,然后进行体外培养,经IL-17诱导后,在不同的时间点采集细胞样品,从蛋白质水平分析RA中IL-17能否诱导破坏软骨基质重要酶ADAMTS-4的表达,再从基因水平检测ADAMTS-4表达量的变化。具体试验方法为:将体外培养软骨细胞分为二组,即IL-17诱导组和未诱导对照组,分别取24h,48h的细胞培养上清液,离心后,采用蛋白质免疫印迹法检测ADAMTS-4蛋白质的表达情况,采用实时定量PCR法检测ADAMTS-4的mRNA的表达量的变化。首先采用Trizol法提取软骨细胞RNA,紫外分光光度仪测定RNA的OD值,并进行琼脂糖凝胶电泳检测提取RNA的质量。将质量合格的RNA逆转录为cDNA,采用PCR扩增ADAMTS-4片段,经琼脂糖凝胶电泳,紫外检测仪下观察PCR扩增结果。分别对两个时间点IL-17处理组软骨细胞与未处理组软骨细胞的cDNA在ABI 7500 real time PCR仪上进行实时定量PCR扩增,同时对每个样品做内参GAPDH的扩增。每个样品重复检测3次,用2-△ΔCt相对定量法分析其mRNA转录改变。制备的类风湿性关节炎动物模型显示,试验大鼠在免疫后,足爪在次日严重红肿,随后肿胀逐渐消退,第7天加强免疫之后,双侧后足爪肿胀明显,前爪也发生继发性肿胀。胶原诱导组发病率为80%,胶原诱导加寒湿刺激组发病率为85%,溶剂对照组没有发病。与对照组相比,两个模型组间血清中抗CⅡ抗体、TNF-α、IL-1β和IL-17的水平均升高,差异极显著(P<0.01),而两个模型组的大鼠血清中抗CⅡ抗体、TNF-α、IL-1β和IL-17水平相比较,胶原诱导加寒湿刺激组比单纯诱导组稍有升高,但是差异不显著(P>0.05)。对照组的大鼠踝关节组织切片可见清晰的关节腔,而两个模型组大鼠踝关节组织切片可见滑膜细胞增生,排列疏散,紊乱,软骨细胞增生,关节腔可见炎性细胞浸润,滑膜组织中淋巴细胞严重浸润。发病大鼠踝关节处X光片的骨关节边缘模糊、软骨破坏、骨变形。采用胰蛋白酶和胶原酶两步消化法成功获得原代的软骨细胞,对软骨细胞进行传代培养后,细胞生长状况良好,软骨细胞经冻存复苏后,活细胞率可以达到87%。经蛋白质免疫印迹分析表明,无论是经IL-17诱导还是未诱导组的软骨细胞均分泌表达ADAMTS-4蛋白,以Trizol法提取软骨细胞中的总RNA经鉴定纯度较好,经逆转录获得的cDNA为模版,以ADAMTS-4的上下游引物进行PCR扩增,可获得约99bp的预期长度的产物片段,条带清晰,无杂带。实时定量PCR检测致炎细胞因子IL-17诱导体外培养软骨细胞的ADAMTS-4的转录水平,发现破坏软骨细胞基质的ADAMTS-4的mRNA转录水平在诱导后24h和48h均显著升高,分别升高了6.37,8.62倍,与对照组相比差异极显著(P<0.01)。通过对临床症状、关节炎指数、抗CⅡ抗体滴度、致炎细胞因子水平、组织病理变化和影像学变化的综合指标评价,本研究成功建立了大鼠类风湿性关节炎疾病模型,为创新药物的临床前研究奠定了基础。在RA整体动物模型中,以ELISA方法检测发现发病大鼠血清中IL-1β、IL-17的水平与对照组相比显著升高,说明创新药物构建的双价抗体以这两种致炎因子为靶标,将会有效的阻断RA的炎症进程。由于本研究旨在为抗IL-1β、IL-17双价的基因工程抗体药物的临床前药理学研究提供基础,考虑到整体动物模型体内环境复杂,为排除各种其他因素的干扰,本研究在体外进行软骨细胞的培养,通过进一步的体外试验研究表明,IL-17诱导组与未诱导组的软骨细胞培养上清液中均可以检测到ADAMTS-4蛋白的表达,实时定量PCR分析结果表明IL-17诱导组软骨细胞ADAMTS-4的表达量明显升高,与未诱导组的差异显著,可以推测在RA患者体内IL-17除了可以通过促进炎症细胞因子TNF-α、IL-1β的分泌,间接促进炎症发展以外,它还可以在关节局部直接通过诱导软骨细胞分泌ADAMTS-4来降解软骨中的蛋白聚糖,破坏软骨基质,使RA患者关节局部发生畸形,甚至残疾,从而在RA病症进程中发挥间接和直接的重要作用,可以推测阻断IL-17的作用是RA治疗中的一个潜在作用靶点,有可能成为有效筛选治疗RA有效药物的方式之一。

全文目录


中文摘要  12-14
英文摘要  14-17
1 引言  17-45
  1.1 类风湿性关节炎动物模型的研究进展  17-22
    1.1.1 单纯诱导性RA 动物模型  17-20
    1.1.2 病证结合的RA 动物模型  20-21
    1.1.3 转基因RA 动物模型  21-22
    1.1.4 Ⅱ型胶原抗体诱导的RA 动物模型  22
  1.2 类风性关节炎主要病因  22-25
    1.2.1 感染因素  22-24
    1.2.2 遗传因素  24-25
  1.3 类风湿性关节炎发病机理的研究进展  25-30
    1.3.1 细胞水平  25-27
    1.3.2 分子水平  27-30
  1.4 IL-17 与 RA 疾病  30-33
    1.4.1 IL-17 结构与成员  30
    1.4.2 IL-17 受体  30-31
    1.4.3 作用机制  31
    1.4.4 生物学作用  31-33
  1.5 多聚蛋白聚糖酶与RA 疾病  33-35
    1.5.1 结构  33-34
    1.5.2 在RA 关节炎中作用  34-35
    1.5.3 调节机制  35
  1.6 软骨细胞的培养概况  35-37
  1.7 蛋白质免疫印迹技术研究进展  37-38
  1.8 实时定量PCR 技术研究进展  38-42
    1.8.1 原理  38-40
    1.8.2 在医学研究中的应用  40-42
  1.9 本研究的目的与意义  42-45
2 材料  45-50
  2.1 制备RA 动物模型的主要试剂  45
  2.2 ELISA 定量检测主要试剂  45
  2.3 培养软骨细胞主要试剂  45-46
  2.4 蛋白质免疫印迹主要试剂  46-47
  2.5 实时定量PCR 主要试剂  47
  2.6 主要仪器与设备  47-48
  2.7 试验动物  48
  2.8 引物合成  48-50
3 方法  50-60
  3.1 类风湿性关节炎动物模型的制备  50-53
    3.1.1 造模方法  50
    3.1.2 血清、踝关节组织的采集  50
    3.1.3 关节炎指数的判定标准与发病率  50-51
    3.1.4 抗Ⅱ型胶原抗体的检测  51
    3.1.5 IL-1β的ELISA 定量检测  51-52
    3.1.6 IL-17、TNF-α的ELISA 定量检测  52
    3.1.7 踝关节组织病理切片的制作  52-53
    3.1.8 影像学检查  53
    3.1.9 数据分析  53
  3.2 软骨细胞的培养  53-54
    3.2.1 原代细胞的分离培养  53
    3.2.2 传代培养  53-54
    3.2.3 冻存与复苏  54
  3.3 IL-17 诱导软骨细胞  54-55
  3.4 Western blot 检测软骨细胞ADAMTS-4 的蛋白质表达  55-57
    3.4.1 蛋白样品的制备  55
    3.4.2 SDS-PAGE 分离ADAMTS-4 基因表达产物  55-56
    3.4.3 ADAMTS-4 的半干式电转移  56
    3.4.4 ADAMTS-4 的免疫学反应  56
    3.4.5 化学发光检测ADAMTS-4 的表达  56-57
  3.5 实时定量PCR 检测软骨细胞ADAMTS-4 的转录水平  57-60
    3.5.1 软骨细胞总RNA 提取和质量鉴定  57
    3.5.2 软骨细胞ADAMTS-4 基因cDNA 的制备  57
    3.5.3 软骨细胞ADAMTS-4 基因的PCR 扩增  57-58
    3.5.4 实时定量PCR 体系确定  58-59
    3.5.5 软骨细胞ADAMTS-4 mRNA 表达的实时定量PCR 检测  59
    3.5.6 数据分析  59-60
4 结果  60-73
  4.1 RA 动物模型制备结果  60-64
    4.1.1 RA 动物模型的临床症状  60
    4.1.2 RA 大鼠的体重变化  60
    4.1.3 发病率  60-61
    4.1.4 关节炎指数结果  61-62
    4.1.5 抗CⅡ抗体的检测结果  62
    4.1.6 IL-1β、TNF-α和IL-17 的水平  62-63
    4.1.7 踝关节组织病理学检查结果  63
    4.1.8 踝关节影象学检查结果  63-64
  4.2 软骨细胞培养结果  64-65
    4.2.1 原代软骨细胞培养结果  64
    4.2.2 传代软骨细胞培养结果  64
    4.2.3 软骨细胞冻存复苏结果  64-65
  4.3 ADAMTS-4 免疫印迹分析结果  65-67
    4.3.1 软骨细胞上清液蛋白浓度  65
    4.3.2 ADAMTS-4 SDS-PAGE 电泳结果  65
    4.3.3 ADAMTS-4 免疫分析结果  65-67
  4.4 软骨细胞的ADAMTS-4 的实时定量PCR 结果  67-73
    4.4.1 软骨细胞RNA 提取质量鉴定结果  67
    4.4.2 软骨细胞ADAMTS-4 PCR 扩增片段鉴定  67-68
    4.4.3 实时定量PCR 体系  68-71
    4.4.4 ADAMTS-4 的实时定量PCR 结果  71-73
5 讨论  73-84
  5.1 RA 动物模型制备  73-76
    5.1.1 造模方法的选择  73
    5.1.2 模型动物血清中抗Ⅱ型胶原抗体水平  73-74
    5.1.3 TNF-α在RA 中的作用  74-75
    5.1.4 IL-1β在RA 中的作用  75
    5.1.5 RA 疾病模型中IL-17 升高的意义  75-76
    5.1.6 大鼠组织病理学与影像学改变  76
  5.2 软骨细胞的培养  76-79
    5.2.1 获取原代软骨细胞的方法选择  76-77
    5.2.2 培养条件的选择  77-78
    5.2.3 生长特点  78
    5.2.4 RA 中软骨细胞的作用  78-79
  5.3 ADAMTS-4 蛋白质免疫印迹结果分析  79-81
    5.3.1 电转印中转膜缓冲液的选择和转膜效率  79
    5.3.2 转移膜的封闭  79
    5.3.3 免疫印迹中抗体的选择  79-80
    5.3.4 底物化学发光的选择  80
    5.3.5 ADAMTS-4 蛋白质免疫印迹结果分析  80-81
  5.4 软骨细胞ADAMTS-4 基因实时PCR 检测结果探讨  81-84
    5.4.1 内参基因的选择  81
    5.4.2 相对定量方法的选择  81-82
    5.4.3 IL-17 诱导软骨细胞后检测靶标的选择  82
    5.4.4 IL-17 诱导软骨细胞上调表达ADAMTS-4 的探讨  82-84
6 结论  84-85
致谢  85-86
参考文献  86-98
附录  98-100
攻读学位期间发表的论文  100

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医内科学
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