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盾壳霉产生抗真菌物质的调控及其分子机理研究

作　者: 韩永超
导　师: 李国庆
学　校: 华中农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 盾壳霉 核盘菌 抗真菌物质 环境pH值 pacC palF CreA 数字化表达谱
分类号: S476
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
下　载: 35次
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内容摘要


盾壳霉(Coniothyrium minitans)是核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的重寄生真菌,在世界范围内广泛分布,在菌核病的生物防治中有着非常重要的作用。本论文主要针对碳源,氮源和环境pH对盾壳霉产生抗真菌物质(AFS)的调控及其分子机理进行了研究。研究发现盾壳霉菌株Chy-1在改良的查比培养基(MCD)中培养时能稳定产生AFS；而在马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)中培养时却不能产生AFS。为了进一步研究盾壳霉在MCD和PDB培养液中生长时产生AFS的差异,研究了营养和环境pH值对盾壳霉产生AFS的影响。结果显示：盾壳霉培养物滤液对核盘菌菌丝生长的抑制率与环境pH值相关,较适宜盾壳霉产生AFS的碳源或氮源,其培养液的环境pH值都较低。当盾壳霉在环境pH值缓冲为3的培养液中生长时,培养滤液对核盘菌菌丝生长的抑制率远远高于当环境pH值缓冲为6的培养液。为了研究环境pH值调控盾壳霉产生抗真菌物质的分子机理,本文用简并引物和RACE技术从盾壳霉菌株Chy-1中克隆到了pH感应转录调控因子基因(cmpacC)和碳代谢抑制因子基因(cmcreA)。cmpacC的全长序列(GenBank Ace. No. FJ176399)含有一个开放阅读框和两个内含子。根据cmpacC的碱基序列推测cmpacC编码一个长度为596个氨基酸残基的蛋白质(GenBank Ace. No. ACN43303),其含有三个保守的锌指结构域。同时本文也用基因组步移的方法克隆到了长度为2740bp的cmpacC 5’端侧翼序列及长度为2730bp的cmpacC 3’端侧翼序列。其中,5’端侧翼序列含有5个PacC结合位点(5’-GCCAAG-3’)和三个CreA结合位点(5’-SYGGRG-3’)。确定了cmpacC转录时的加A位点。荧光定量RT-PCR的分析结果显示：当盾壳霉在不同环境pH条件下生长时,cmpacC、几丁质酶基因(cmchl)(?)口p-1,3-葡聚糖酶基因(cmgl)的表达量都随着环境pH值的上升而升高。当盾壳霉在以单糖为碳源的培养基中生长时,cmcreA基因的表达量低,而当碳源为微生物不易利用的多糖时,cmcreA的相对表达量高。利用农杆菌介导同源重组的方法对盾壳霉中cmpalF基因进行了敲除。结果显示：当cmpalF基因缺失后,cmpacC的表达量降低,在环境pH高于6的环境中生长速度显著低于野生型菌株。在缓冲环境pH值为6时,培养滤液对核盘菌菌丝生长的抑制率显著高于野生型菌株。用数字化表达谱技术分析了盾壳霉菌株Chy-1在环境pH值为3和6条件下RNA转录水平的表达差异基因。共得到了1286个差异表达的基因,以盾壳霉RNA样品Cm3的基因表达量为参照时,RNA样品Cm6中有596个基因上调表达,690个基因下调表达。上述结果为解释盾壳霉与核盘菌之间的互作以及进一步揭示盾壳霉产生AFS的分子机制奠定了基础。

全文目录


摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
缩略词表  12-14
第一章 文献综述  14-25
  1 核盘菌的研究进展  14-17
    1.1 核盘菌及其作物菌核病  14
    1.2 核盘菌的致病因子  14-15
    1.3 菌核病的防治  15-16
    1.4 生物防治  16-17
  2 盾壳霉的研究进展  17-21
    2.1 盾壳霉的生物学特性  17
    2.2 盾壳霉的分布及多样性  17-18
    2.3 盾壳霉的生态学研究  18-19
    2.4 盾壳霉对菌核病的生物防治效果  19
    2.5 盾壳霉防治核盘菌的主要机制  19-20
    2.6 盾壳霉降解草酸的研究  20-21
    2.7 盾壳霉的分子生物学研究  21
  3 真菌产生抗生素或毒素的研究  21-22
  4 环境pH调控的研究进展  22-24
    4.1 受环境pH调控的基因  22-23
    4.2 pH调控的分子机理  23-24
  5 研究内容和意义  24-25
第二章 碳氮源与环境pH值对盾壳霉产生AFS的影响  25-40
  1 材料和方法  25-29
    1.1 供试菌株  25
    1.2 培养基  25-26
    1.3 试剂  26
    1.4 仪器与设备  26
    1.5 盾壳霉培养物滤液对核盘菌菌生长抑制作用的测定  26
    1.6 碳源对盾壳霉产生AFS的影响  26-27
    1.7 碳源与环境pH值对盾壳霉产生AFS的影响  27
    1.8 氮源对盾壳霉产生AFS的影响  27-28
    1.9 氮源与环境pH值对盾壳霉产生AFS的影响  28
    1.10 盾壳霉寄生核盘菌过程中AFS的产生  28-29
    1.11 核盘菌菌丝或菌核提取物作为营养物质对盾壳霉产生AFS的影响  29
    1.12 数据统计  29
  2 结果与分析  29-38
    2.1 碳源对盾壳霉产生AFS的影响  29-31
    2.2 碳源与环境pH值对盾壳霉产生AFS的影响  31-33
    2.3 氮源对盾壳霉产生AFS的影响  33-34
    2.4 氮源与环境pH值对盾壳霉产生AFS的影响  34-36
    2.5 盾壳霉寄生核盘菌过程中AFS的产生  36-37
    2.6 核盘菌菌丝或菌核提取物作为营养物质对盾壳霉产生AFS的影响  37-38
  3 讨论  38-40
第三章 酸性环境对盾壳霉产生AFS及对AFS活性的影响  40-49
  1 材料和方法  40-43
    1.1 菌株  40
    1.2 培养基  40
    1.3 试剂  40-41
    1.4 仪器与设备  41
    1.5 盾壳霉培养物滤液对核盘菌菌生长抑制率的测定  41
    1.6 盐酸营造的酸性环境对盾壳霉产生AFS的影响  41
    1.7 环境pH值对AFS活性的影响  41-42
    1.8 盾壳霉分生孢子在草酸出现时的防病效果  42
    1.9 数据统计分析  42-43
  2 结果与分析  43-47
    2.1 盐酸营造的酸性环境对盾壳霉产生AFS的影响  43-44
    2.2 环境pH值对盾壳霉AFS活性的影响  44-45
    2.3 盾壳霉分生孢子在草酸出现时的防病效果  45-47
  3 讨论  47-49
第四章 环境pH值调控盾壳霉产生AFS的分子机理  49-64
  1 材料和方法  50-54
    1.1 供试菌株  50
    1.2 培养基  50
    1.3 试剂  50-51
    1.4 仪器与设备  51
    1.5 核酸的提取  51
    1.6 盾壳霉pacC同源序列的克隆  51-52
    1.7 盾壳霉cmpacC基因全长的克隆  52
    1.8 Southern杂交分析  52-54
    1.9 cmpacC基因的系统发育进化分析  54
  2 结果与分析  54-63
    2.1 盾壳霉中pacC基因同源片段的克隆  54-56
    2.2 盾壳霉中pacC同源基因5'末端的克隆  56
    2.3 盾壳霉中pacC同源基因3'末端序列的克隆  56-57
    2.4 盾壳霉pacC同源基因序列拼接  57-58
    2.5 Southern杂交分析  58-59
    2.6 cmpacC序列分析  59-62
    2.7 cmpacC基因系统发育进化分析  62-63
  3 讨论  63-64
第五章 cmpacC的表达模式分析及启动子克隆  64-80
  1 材料和方法  65-73
    1.1 供试菌株  65
    1.2 培养基  65
    1.3 试剂  65-66
    1.4 仪器与设备  66
    1.5 核酸的提取  66
    1.6 盾壳霉actin同源片段的克隆  66-67
    1.7 cmact1序列分析  67
    1.8 不同环境pH下cmpacC,cmch1或cmg1的表达模式分析  67-69
    1.9 cmpacC基因侧翼序列的克隆  69-73
  2 结果与分析  73-78
    2.1 盾壳霉actin基因同源片段的克隆及分析  73-75
    2.2 不同环境pH下cmpacC,cmch1或cmg1的表达模式  75-76
    2.3 cmpacC侧翼序列的克隆及分析  76-78
  3 讨论  78-80
第六章 盾壳霉cmcreA基因的克隆和表达分析  80-90
  1 材料和方法  80-85
    1.1 供试菌株  80-81
    1.2 培养基  81
    1.3 试剂  81
    1.4 仪器与设备  81
    1.5 盾壳霉creA同源基因的克隆  81-82
    1.6 cmcreA 3'末端序列的克隆  82
    1.7 cmcreA序列分析  82-83
    1.8 cmcreA的表达模式分析  83-85
  2 结果与分析  85-89
    2.1 盾壳霉creA基因同源片段的克隆  85
    2.2 cmcreA基因cDNA 3'末端序列的克隆  85-86
    2.3 cmcreA的序列分析  86-87
    2.4 cmcreA的表达模式分析  87-89
  3 讨论  89-90
第七章 cmpalF基因的克隆及其功能验证  90-108
  1 材料和方法  90-100
    1.1 供试菌株  90
    1.2 培养基  90-91
    1.3 试剂  91-92
    1.4 仪器与设备  92
    1.5 PCR产物纯化  92
    1.6 PCR产物加A  92-93
    1.7 质粒提取  93
    1.8 农杆菌感受态的制备  93
    1.9 农杆菌感受态的热击转化  93-94
    1.10 cmpalF的敲除  94-98
    1.11 cmpalF敲除突变体对环境pH的适应  98-99
    1.12 cmpalF对盾壳霉抗真菌物质产生的影响  99
    1.13 cmpalF对cmpacC表达的影响  99-100
    1.14 数据统计分析  100
  2 结果与分析  100-106
    2.1 cmpalF的敲除  100-102
    2.2 cmpacF敲除突变体对环境pH的适应  102-103
    2.3 cmpalF对盾壳霉产生抗真菌物质的影响  103-105
    2.4 cmpalF对cmpacC表达的影响  105-106
  3、讨论  106-108
第八章 环境pH值诱导盾壳霉差异表达基因的分析  108-121
  1 材料和方法  108-112
    1.1 供试菌株  108-109
    1.2 培养基  109
    1.3 试剂  109
    1.4 仪器设备  109
    1.5 盾壳霉菌丝的培养和收集  109
    1.6 差异表达基因的克隆和筛选  109-110
    1.7 数据处理的步骤  110-111
    1.8 标签的基因注释、标准化和确定基因表达量返回信息分析流程  111-112
    1.9 差异表达基因的筛选  112
    1.10 差异表达基因的功能分类  112
  2 结果与分析  112-120
    2.1 盾壳霉不同环境pH值下菌丝RNA的提取及质量检测  112-113
    2.2 测序评估  113-117
    2.3 差异表达基因的筛选  117-118
    2.4 差异表达基因的功能分类  118-119
    2.5 与盾壳霉产生抗真菌物质相关的差异表达的基因  119-120
  3 讨论  120-121
第九章 结论与展望  121-124
  1 结论  121-122
  2 展望  122-124
参考文献  124-136
致谢  136-137
附录1 盾壳霉DNA提取  137-138
附录2 盾壳霉总RNA提取  138-139
附录3 PCR扩增DNA片段的回收与纯化  139-140
附录4 PCR扩增产物的克隆测序  140-142
附录5 5'末端序列的克隆(5'RACE)  142-147
附录6 3'末端序列的克隆(3'RACE)  147-150
附录7 cmpacC及其侧翼序列  150-153
附录8 博士在读期间已发表的文章  153

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治
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