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盾壳霉产抗细菌物质相关基因的克隆及抗细菌物质生态学功能的研究

作　者: 尹晓艳
导　师: 姜道宏
学　校: 华中农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 盾壳霉 抗细菌物质 生态学 MADS-box1 基因敲除 核盘菌
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 15次
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内容摘要


盾壳霉(Coniothyrium minitans)是核盘菌(Sclerotinia sclerotirium)的重要寄生真菌，在世界范围内广泛存在，是菌核病的一种重要生防菌。本文以水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)为指示菌，对盾壳霉ZS-1菌株的T-DNA标记插入突变体库，进行了产抗细菌物质(ABS，Antibacterial substances)缺陷型突变体的筛选，以突变体ZS-1T12003为材料克隆到产抗生素相关的基因，并以该突变体为材料，对盾壳霉产生的ABS的生态学功能进行了研究，结果如下：从盾壳霉ZS-1菌株T-DNA标记插入突变体库中筛选出的产ABS缺陷型突变体ZS-1T12003、ZS-1T24630及ZS-1T25680。ZS-1T12003产孢正常，生长速度及寄生致腐核盘菌菌核的能力与出发菌株ZS-1无显著性差异(P＜0.05)，在PDA培养基上不产生抗真菌物质；ZS-1T25680不产孢，生长速度及寄生致腐核盘菌菌核的能力与ZS-1存在显著性差异(P＜0.05)，在PDA培养基上产生少量的抗真菌物质；ZS-1T24630仅产少量的孢子，生长速度及寄生致腐核盘菌菌核的能力与ZS-1存在显著性差异(P＜0.05)，在PDA培养基上不产生抗真菌物质。Southern杂交证实T-DNA标记在突变体ZS-1T12003中为单拷贝插入；以ZS-1T12003为材料，采用TAIL-PCR和RT-PCR技术对T-DNA标记插入位点的基因组DNA进行了克隆，获得了大小为1336bp的DNA片段：对该基因组DNA片段进行了序列分析，并利用GenScan软件进行了阅读框(ORF)预测：位于第77nt开始的ATG为起始密码子，该DNA片段中含有一个完整的阅读框：起始外显子(77-328nt)；中间外显子(454-588nt)；末端外显子(640-924nt)，编码223aa。对推定的氨基酸序列进行功能预测，发现该序列中含有一保守的区域，即MADS-box域，故命名该基因为CMMADS-box1。CMMADS-box1与其它真菌的MADS-box具有高度的同源性，如与大孢粪壳霉菌(Sordaria macrospora)的MADS-box相同部位等同的氨基酸为67％，类似的氨基酸达74％：T-DNA标记破坏该基因的启动子。Southern杂交证实CMMADS-box1基因在菌株ZS-1的基因组中为单拷贝；RT-PCR结果表明CMMADS-box1基因在ZS-1T12003基因组中不表达，在菌株ZS-1的基因组中表达。构建了CMMADS-box1基因敲除载体，利用农杆菌介导转化的方法，获得了CMMADS-box1敲除转化子03GDT02，该转化子对水稻白叶枯病菌(X.oryzae pv.oryzae)不具有拮抗活性，与ZS-1T12003表现出了相同的产ABS缺陷这一性状；03GDT02、ZS-1及ZS-IT12003三菌株的菌落形态无显著差别，在PDA培养基上均不产生抗真菌物质。为了研究盾壳霉产生的ABS的生态学作用，并排除T-DNA标记插入的影响，从突变体库中筛选到了一个突变体ZS-1T21559，其菌落形态、产ABS的能力、生长速度及寄生致腐核盘菌菌核的能力与出发菌株ZS-1没有显著性差异(P＜0.05)；出发菌株ZS-1、突变体ZS-1T12003、ZS-1T21559的生长速度和产孢能力不存在显著性差异(P＜0.05)；在PDA培养基上与核盘菌菌株Ep-1PNAa对峙培养过程中，未见抑菌圈的产生；无菌条件下及在自然土中寄生致腐核盘菌菌核的能力无显著性差异(P＜0.05)；ZS-1T12003与ZS-1T21559的孢子等量加入到放有菌核的自然土和灭菌土中的实验表明：随着培养时间的延长，ZS-1T12003每克菌核上的孢子量显著低于ZS-1T21559每克菌核上的孢子量(P＜0.05)，这说明：ZS-1T21559与ZS-1T12003相比，表现出成活和竞争的优势；出发菌株ZS-1和突变体ZS-1T12003、ZS-1T21559三菌株在被核盘菌侵染的油菜叶片上的定殖能力无显著性差异(P＜0.05)。这些试验表明：盾壳霉突变体ZS-1T12003所缺失的ABS在盾壳霉的生存过程中，起到了一定的帮助其竞争的作用，但其所发挥的帮助盾壳霉竞争的作用对盾壳霉的生命活动不是至关重要的，只有在不适宜盾壳霉生长的条件下，这种帮助盾壳霉竞争的作用会表现的突出些。本文为理解抗生素在微生物生活中的作用提供一个实例，同时为研究盾壳霉产ABS的调控过程提供基因材料和思路。

全文目录


摘要  8-10
Abstract  10-12
缩略词表  12-14
第一章 文献综述  14-24
  1 核盘菌的研究进展  14-16
    1.1 核盘菌的危害  14
    1.2 核盘菌的生物学、生态学特性  14-15
    1.3 作物菌核病的防治  15-16
  2 盾壳霉的研究进展  16-18
    2.1 盾壳霉的生物学特性  16-17
    2.2 盾壳霉的生态学特性  17
    2.3 盾壳霉的分子生物学研究  17-18
  3 产ABS真菌的研究进展  18-19
    3.1 产ABS真菌的种类  18
    3.2 真菌所产的次级代谢物对其生活的作用  18-19
    3.3 真菌中寻找次级代谢物相关基因的意义  19
  4 真菌功能基因研究进展  19-22
    4.1 真菌的遗传转化  19-21
    4.2 基因功能验证  21-22
  5 本项研究的意义  22-24
第二章 盾壳霉产抗细菌物质缺陷型突变体的获得和基本生物学性状的测定  24-31
  1 材料与方法  24-26
    1.1 材料  24
      1.1.1 菌株  24
      1.1.2 培养基  24
    1.2 方法  24-26
      1.2.1 产ABS缺陷型突变体的筛选  24-25
      1.2.2 产ABS缺陷型突变体的形态特征观察  25
      1.2.3 产ABS缺陷型突变体的生长速度测定  25
      1.2.4 产ABS缺陷型突变体在PDA培养基上产抗真菌物质的测定  25
      1.2.5 产ABS缺陷型突变体寄生致腐菌核能力的测定  25-26
      1.2.6 数据统计分析  26
  2 结果与分析  26-29
    2.1 产ABS缺陷型突变体筛选结果  26
    2.2 产ABS缺陷型突变体的形态特征观察  26-27
    2.3 产ABS缺陷型突变体生长速度测定  27
    2.4 产ABS缺陷型突变体在PDA培养基上产抗真菌物质的测定  27-28
    2.5 产ABS缺陷型突变体寄生致腐菌核能力的测定  28-29
  3 结论和讨论  29-31
    3.1 结论  29
    312讨论  29-31
第三章 盾壳霉产抗细菌物质相关基因的克隆  31-50
  1 材料与方法  31-41
    1.1 材料  31-33
      1.1.1 菌株  31
      1.1.2 培养基、载体及抗生素  31
      1.1.3 质粒抽提用溶液  31-32
      1.1.4 Southern杂交用溶液及试剂  32
      1.1.5 其它溶液及试剂  32
      1.1.6 限制性内切酶及其它酶类、试剂盒及其它试剂  32
      1.1.7 引物  32-33
    1.2 方法  33-41
      1.2.1 菌丝培养(用于基因组DNA的提取)  33
      1.2.2 基因组DNA的提取  33-34
      1.2.3 Southern杂交分析突变体中T-DNA的插入位点数  34-35
        1.2.3.1 酶切、电泳、转膜及固定  34
        1.2.3.2 预杂交  34
        1.2.3.3 探针标记及杂交  34-35
        1.2.3.4 洗膜及压片  35
      1.2.4 TAIL-PCR克隆T-DNA侧端序列  35-36
      1.2.5 目的片段的回收及纯化  36
      1.2.6 回收产物与克隆载体连接  36-37
      1.2.7 利用大肠杆菌感受态细胞转化连接产物  37-38
        1.2.7.1 大肠杆菌感受态细胞的制备  37-38
        1.2.7.2 热击转化  38
      1.2.8 重组质粒的筛选、提取及鉴定  38-39
        1.2.8.1 重组质粒的筛选  38
        1.2.8.2 重组质粒的提取  38
        1.2.8.3 重组质粒的鉴定  38-39
      1.2.9 克隆序列分析  39
      1.2.10 目的基因片段的全长序列的克隆  39-41
        1.2.10.1 ZS-1菌株RNA的提取  39
        1.2.10.2 通过RACE获得3’末端cDNA  39-40
        1.2.10.3 目的片段的回收、连接和鉴定  40-41
        1.2.10.4 序列拼接及分析  41
      1.2.11 Southern杂交分析ZS-1中CMMADS-box1的拷贝数  41
        1.2.11.1 酶切、电泳、转膜及固定、预杂交  41
        1.2.11.2 探针标记、杂交、洗膜及压片  41
  2 结果与分析  41-47
    2.1 Southern杂交分析产ABS缺陷型突变体ZS-1T12003中T-DNA插入位点数  41
    2.2 TAIL-PCR获得T-DNA插入位点侧端基因组DNA序列  41-43
    2.3 CMMADS-box1全长序列的克隆  43
    2.4 Southen杂交分析ZS-1中CMMADS-box1的拷贝数  43-47
  3 结论和讨论  47-50
    3.1 结论  47-48
    3.2 讨论  48-50
第四章 盾壳霉产抗细菌物质相关基因功能的验证  50-61
  1 材料和方法  50-55
    1.1 材料  50-51
      1.1.1 菌株、载体、抗生素及引物  50
      1.1.2 试剂及培养基  50-51
    1.2 方法  51-55
      1.2.1 RT-PCR验证ZS-1T12003中CMMADS-box1基因的表达  51
      1.2.2 盾壳霉CMMADS-box1敲除载体的构建  51-52
      1.2.3 含重组质粒农杆菌的获取  52-54
        1.2.3.1 农杆菌感受态的制备及热击转化  52-53
        1.2.3.2 农杆菌质粒的PCR鉴定  53-54
      1.2.4 农杆菌介导转化盾壳霉  54
      1.2.5 盾壳霉CMMADS-box1敲除转化子PCR鉴定  54-55
        1.2.5.1 转化子基因组DNA的提取  54
        1.2.5.2 转化子PCR扩增  54-55
      1.2.6 盾壳霉CMMADS-box1敲除转化子基本生物学性状的测定  55
  2 结果与分析  55-59
    2.1 ZS-1T12003中CMMADS-box1基因不表达  55-56
    2.2 盾壳霉CMMADS-box1敲除载体的构建及鉴定  56
    2.3 含重组质粒农杆菌的鉴定  56
    2.4 农杆菌介导盾壳霉转化  56
    2.5 盾壳霉CMMADS-box1敲除转化子PCR鉴定结果  56
    2.6 盾壳霉CMMADS-box1敲除转化子基本生物学性状的测定结果  56-59
      2.6.1 03GDT02形态特征的观察  56-58
      2.6.2 03GDT02产ABS的检测  58-59
      2.6.3 03GDT02在PDA上产抗真菌物质的测定  59
  3 结论和讨论  59-61
    3.1 结论  59-60
    3.2 讨论  60-61
第五章 盾壳霉所产抗细菌物质对盾壳霉的生态学功能研究  61-73
  1 实验材料与方法  61-64
    1.1 实验材料  61
      1.1.1 菌株  61
      1.1.2 药品  61
      1.1.3 培养基  61
    1.2 方法  61-64
      1.2.1 突变体库中产ABS正常突变体的筛选  62
      1.2.2 突变体及ZS-1生长速度和抗真菌物质的测定  62
      1.2.3 突变体及ZS-1产孢能力的测定  62
      1.2.4 突变体及ZS-1对核盘菌菌核寄生致腐菌核能力的测定  62-63
        1.2.4.1 无菌条件下的测定  62
        1.2.4.2 自然土中的测定  62
        1.2.4.3 越冬时的测定  62
        1.2.4.4 越夏时的测定  62-63
      1.2.5 突变体在土壤中的竞争能力测定  63
      1.2.6 突变体及ZS-1在油菜叶片上定殖能力的测定结果  63
      1.2.7 数据统计分析  63-64
  2 结果与分析  64-70
    2.1 突变体库中产ABS正常突变体的筛选  64
    2.2 突变体及ZS-1生长速度及产抗真菌物质的测定  64-65
    2.3 突变体及ZS-1产孢能力的比较  65-66
    2.4 突变体及ZS-1对核盘菌菌核寄生致腐菌核能力的测定结果  66-68
    2.5 菌株在土壤中的竞争能力测定  68-69
    2.6 突变体及ZS-1在油菜叶片上定殖能力的测定结果  69-70
  3 结论和讨论  70-73
    3.1 结论  70-71
    3.2 讨论  71-73
结论与展望  73-75
参考文献  75-83
致谢  83

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治
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