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应用去分化脂肪细胞构建工程化脂肪组织的实验研究

作　者: 廖云君
导　师: 高建华
学　校: 南方医科大学
专　业: 整形外科学
关键词: 去分化脂肪细胞(DA) 脂肪组织工程 Ⅰ型胶原支架纤维蛋白胶支架可注射 GFP荧光标记体内体外
分类号: R329
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景及目的随着整复重建外科的发展,自体组织移植及人工材料替代修复软组织缺损成为重要的治疗手段,尽管这能有效地改善受区的组织缺损状况,但自体移植物的来源十分有限,又常受到血供及其供区的继发畸形的限制,游离脂肪移植的自体吸收率较高,人工材料易产生排斥反应等,故目前这些方法的治疗效果均不是十分理想,难以完全满足临床的需要。组织工程技术的出现为临床上更好的解决组织缺损等难题提供了一个新的思路。近年来,组织工程技术能以少量种子细胞,经体外扩增后与生物材料复合,修复较大的组织或器官缺损,重建生理功能,为真正实现无损伤修复组织缺损和真正意义上的形态、结构与功能重建开辟了新的途径。组织工程学的发展需要几个必备的因素,即：(1)可获得的种子细胞,并能控制其生长和组织形成；(2)结构精确的三维支架,以适合再造需要的组织量和形状,而且与细胞具有良好的组织相容性；(3)适宜的微环境,能提供充分的血供和营养,维持细胞增殖和组织功能。近年来,人脂肪组织来源的干细胞(Adipose derived stem cells, ASCs)成为当今干细胞研究领域的一大热点。但ASCs是位于人脂肪组织内的一个混杂细胞群体。只有大约40%的细胞能向脂肪细胞分化。因此,ASCs并不能完全满足脂肪组织工程的发展需要。故寻找一种分离容易、增殖能力强、成脂分化率高的更优秀的种子细胞仍然是研究热点。脂肪组织内含有多种不同的细胞,主要有成熟脂肪细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、组织细胞和干细胞等。大量的脂质聚集使脂肪细胞具有的漂浮性,导致细胞难于体外培养,因此对该细胞的特性研究很少。脂肪细胞由此被认为是处于分化终末期,缺乏增殖能力的一种细胞。有研究表明,成熟脂肪细胞在体外培养的过程中,能脱去脂滴,重新启动增殖机制,开始分裂增生。我们把这种生理转变称之为脂肪细胞去分化。脂肪细胞去分化将开创细胞生理学一个令人惊喜的领域,改变人们对于组织再生能力的许多观点。然而,关于去分化脂肪细胞(dedifferentiate adipocyte, DA)的细胞生物学特性研究还很少。前期研究证实DA在体外定向诱导培养下具有向成脂、成骨、成软骨分化等多向分化能力,且较之ASCs有更高的成脂能力。因此,DA有可能成为脂肪组织工程更具前景的种子细胞来源。组织工程常用的支架材料分为天然材料和人工合成材料,天然材料包括：天然多糖类材料有纤维素、甲壳素、透明质酸等；天然蛋白质类材料有胶原和纤维蛋白等；人工合成的材料有聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)或两者聚合物聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)、聚四氟乙烯、羟基磷灰石、聚乙烯醇、海藻酸盐等。依据他们各自特点,被不同程度地应用于组织工程的研究。由于应用脂肪细胞组织工程技术修复软组织缺损近期才引起学者们的关注,故而用于构建脂肪组织工程有效的生物材料支架研究不多,目前常用的有可降解的多孔泡沫,如PLGA、透明质酸、膨体聚四氟乙烯等,然而,究竟何种材料能成为脂肪组织工程种子细胞的理想载体尚不十分明确,如果能找出最适合构建工程化脂肪的支架材料,将能大大促进脂肪组织工程的研究。本实验拟研究人DA向脂肪细胞、成骨细胞体外定向诱导分化中相关基因表达,同时判断种子细胞与Ⅰ型固态胶原支架及纤维蛋白胶可注射支架复合后在体内构建组织工程化脂肪组织的可能性,以寻找适宜的脂肪组织工程种子细胞载体,探索构建组织工程化脂肪组织的有效方法；另外,对DA进行AD、EGFP体外荧光标记,观察该标记物对细胞生物性状的影响,为种子细胞研究寻找理想的细胞标记方法。方法1、DA、ASCs的分离、培养及检测自成人吸脂术后抽吸物提取成熟脂肪细胞及ASCs,天花板贴壁培养法诱导成熟脂肪细胞去分化,观察细胞形态变化,获得DA。同时对细胞进行体外定向成脂、成骨诱导分化,并以油红0染色、茜素红染色进行鉴定。Real-time PCR分析细胞内PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、Leptin、LPL、RUNX2、SOX9的表达水平。2.Ad.EGFP转染并标记DAAd.EGFP按不同感染复数(multiphcity of infection, MOI)值(MOI=0,10,20,30,50,100)体外转染DA,进行EGFP荧光标记,倒置显微镜及荧光显微镜观察细胞生长情况及传代后荧光强度的变化；测定腺病毒转染DA的效率；油红0染色检测细胞标记后成脂能力。使用MTT比色分析法检测标记前后细胞的增殖情况,同时将培养细胞上清液进行乳酸脱氢酶(LDH)含量测定,检测Ad.EGFP对细胞的毒性。3、DA与海绵状Ⅰ型胶原蛋白、纤维蛋白胶生物相容性的检测将标记后的DA分别与Ⅰ型胶原蛋白海绵支架、纤维蛋白胶体外联合培养,测定细胞在支架上的黏附率,相差显微镜及电子显微镜动态观察细胞在支架上黏附、伸展、生长和增殖情况；使用台盼蓝拒染法检测细胞活力,油红0染色检测细胞复合支架后成脂能力。4、体内工程化脂肪组织的构建将Ⅰ型胶原支架与纤维蛋白胶可注射支架分别与GFP标记的成脂诱导后DA或ASCs混合,设空白支架为对照组,同体双侧植入裸鼠背部皮下,12周后取出植入物。进行组织工程新生物大体观察和湿重测定后荧光显微镜观察大体组织标本,最后组织学检测、HE染色定性。血管计数法检测新生物血管密度。结果1.分离培养的DA形态类似于成纤维细胞,具有很强的增殖及多向分化能力。在脂肪、成骨分化诱导培养基的作用下,分化出成熟的脂肪细胞和成骨细胞,油红0、茜素红染色阳性。细胞诱导分化前,DA内PPARγ、C/EBPβ的表达高于ASCs,而RUNX2.SOX9的表达低于ASCs.细胞成脂诱导后,DA内PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、Leptin、LPL的基因表达始终高于ASCs,增加的幅度更大；而成骨诱导后,ASCs内RUNX2的表达水平始终高于DA。2.Ad.EGFP可成功进入DA。24h可见绿色荧光,5d荧光表达强度明显较高,DA传代后仍有强荧光表达。转染DA后,不影响其增殖活性。MOI为0、10、20、30、50、100时转染率分别为0%、11.3%、28.5%、43.7%、95.8%、96.3%。细胞标记后不影响向脂肪细胞分化的能力。3.DA可以在海绵状Ⅰ型胶原蛋白支架、纤维蛋白胶支架上生长并逐渐黏附,细胞与不同的支架混合,细胞在支架上的黏附率也不同：DA在海绵状Ⅰ型胶原蛋白支架组(n=6)的细胞黏附率为77.67%±3.33%；DA在纤维蛋白胶组(n=6)的细胞黏附率为91.83%±2.79%,两组采用独立样本t检验比较差异有统计学意义(t=7.996,P<0.001)。而DA在海绵状Ⅰ型胶原蛋白支架组(n=6)的细胞成脂分化率为63.0%±3.0%；DA在纤维蛋白胶组(n=6)的细胞成脂分化率为63.2%±3.3%,两组采用独立样本t检验比较无显著性差异(t=0.091,P=0.929)。DA与支架混合培养后不影响细胞的形态、生长增殖状况,细胞与支架复合后不影响向脂肪细胞分化的能力。4.术后12w取材发现,DA-胶原蛋白组、ASCs-胶原蛋白组、DA-纤维蛋白胶组、ASCs-纤维蛋白胶组于移植物包埋区均可观察到新生组织形成；空白对照组(完全培养基-胶原支架组、完全培养基-纤维蛋白胶组)均未见新生组织形成。DA-胶原蛋白组(n=6)新生组织平均湿重为0.0728±0.0184g；ASCs-胶原蛋白组(n=6)新生组织平均湿重为0.0732±0.0198g；DA-纤维蛋白胶组(n=6)新生组织平均湿重为0.1109±0.0020g, ASCs-纤维蛋白胶组(n=6)新生组织平均湿重为0.1080±0.0028g。DA-胶原蛋白组与ASCs-胶原蛋白组、DA-纤维蛋白胶组与ASCs-纤维蛋白胶组之间湿重比较,无显著性差异(均为P>0.05)。HE染色证实新生组织均为成熟脂肪组织,支架已完全吸收降解；免疫荧光染色阳性证实新生组织为外源性。各组新生微血管密度分别为：DA-胶原蛋白组11.22±2.53;ASCs-胶原蛋白组15.22±2.39；DA-纤维蛋白胶组10.72±2.42:ASCs-纤维蛋白胶组15.00±2.54。DA-胶原蛋白组与ASCs-胶原蛋白组、DA-纤维蛋白胶组与ASCs-纤维蛋白胶组之间微血管密度比较,差异有统计学意义(P均<0.05)。各组新生物纤维化程度分别为：DA-胶原蛋白组24.90%±0.49%；ASCs-胶原蛋白组25.10%±0.73%;DA-纤维蛋白胶组25.00%±0.75%；ASCs纤维蛋白胶组24.70%±0.72%。DA-胶原蛋白组与ASCs-胶原蛋白组、DA-纤维蛋白胶组与ASCs-纤维蛋白胶组之间纤维化程度比较,无显著性差异(均为P>0.05)。在体内,DA表达内皮细胞表面标记——CD31,参与血管的形成。讨论种子细胞是构建组织工程脂肪核心问题之一。在脂肪组织中成熟脂肪细胞已被证实能去分化为DA, DA具有强增殖能力,多向分化能力,高成脂分化率。本实验从人脂肪组织成功获取脂肪细胞,天花板贴壁培养诱导去分化获得DA。DA作为种子细胞与其他细胞相比具有相当的优越性,该细胞来源广泛、取材容易,大量获取,高成脂分化率。组织工程另一核心内容是寻找具有组织再生潜力的支架材料。在生物材料方面,已开发和研制了适用于不同组织构建的生物支架材料。各类材料都具有各自的优点和缺点,而胶原蛋白在组织工程构建中作为支架材料的效果已被肯定。在这个实验中,显示胶原蛋白作为支架材料与ASCs有良好的相容性及黏附性,对细胞无毒性,不影响细胞增殖。同时,细胞标记一直是困扰组织工程技术修复机制研究的一大难题,其在干细胞来源的种子细胞的缺损修复研究中尤为重要。寻找一种直观、长期稳定,同时不影响细胞组织形成能力的标记方法非常重要。在本实验中,EGFP对DA成功进行了标记,且具有上述优点。在这个实验中,脂肪分化诱导后的DA与ASCs一样,与Ⅰ型胶原、或纤维蛋白胶支架混合培养后能在裸鼠皮下新生结构功能完整的脂肪组织块。该研究提示,DA作为种子细胞的确可以应用于脂肪组织的组织工程研究,并且能合成具有三维结构及功能的脂肪组织。结论1、本实验成功地从人皮下脂肪组织中诱导培养出DA,建立了一整套有关DA分离、培养和鉴定的较简便的方法。DA具有很强的增殖和自我更新能力,具有向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化的潜能,尤其是高成脂分化力。DA来源丰富、取材容易,创伤小,是理想的组织工程种子细胞,具有广阔的应用前景。2、腺病毒是较好的基因载体,是一个高效、安全快捷的基因修饰操作系统,EGFP在DA中能持续稳定表达,将为基因治疗和细胞示踪提供有效的实验方法。EGFP对细胞无毒副作用,安全性高,对细胞的生长增殖及成脂分化无明显影响。3、DA可以在海绵状Ⅰ型胶原蛋白、纤维蛋白胶支架上逐渐黏附,细胞黏附率高,生长、增殖良好。支架对细胞无毒性反应。海绵状Ⅰ型胶原蛋白、纤维蛋白胶材料与DA之间具有良好的生物相容性。4、以胶原蛋白和可注射型纤维蛋白胶为支架材料,复合体外培养的人DA,能在体内成功构建成熟的脂肪组织块,并证实细胞参与血管内皮的构成。该研究提示,DA也能为将来软组织缺损的组织工程修复提供重要的种子细胞来源,并为体内研究脂肪细胞的生长代谢提供了研究模型。

全文目录

摘要  3-9
ABSTRACT  9-19
前言  19-24
第一部分去分化脂肪细胞分化过程中相关基因的检测分析  24-53
  引言  24-26
  材料与方法  26-35
  结果  35-47
  讨论  47-52
  结论  52-53
第二部分 DA体外Ad.EGFP荧光标记及观察标记物对细胞生物性状的影响  53-67
  引言  53-54
  材料与方法  54-57
  结果  57-61
  讨论  61-66
  结论  66-67
第三部分 DA与Ⅰ型胶原蛋白、纤维蛋白胶支架生物相容性的体外实验研究  67-85
  引言  67-68
  材料与方法  68-70
  结果  70-78
  讨论  78-84
  结论  84-85
第四部分 DA复合Ⅰ型胶原蛋白、可注射性纤维蛋白胶为支架构建组织工程脂肪的体内实验研究  85-103
  引言  85-87
  材料和方法  87-90
  结果  90-98
  讨论  98-102
  结论  102-103
全文小结  103-104
参考文献  104-119
中英文缩略词对照表  119-120
攻读学位期间的成果  120-121
致谢  121-123
统计学证明  123

应用去分化脂肪细胞构建工程化脂肪组织的实验研究

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