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基于逆转录病毒载体的高效表达系统的建立和应用

作　者: 许建
导　师: 陈昭烈
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 细胞生物学
关键词: 逆转录病毒载体人重组C蛋白高效表达细胞系表达调控元件
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

逆转录病毒表达系统是近年来新兴起的一种高效表达系统,它由逆转录病毒载体,包膜蛋白载体和包装细胞系构成。由于逆转录病毒和宿主细胞基因组的重组倾向于发生在转录活性区,口炎疱疹病毒G蛋白能有效扩大逆转录病毒感染宿主细胞的范围、提高逆转录病毒的感染效率。与质粒转染等其他传统的外源基因介导方法相比,逆转录病毒表达系统可以大大提高获得高效表达外源基因细胞系的几率。本课题的主要研究目标是建立和评价以逆转录病毒载体介导的外源基因高效表达系统,利用基于逆转录病毒载体的外源基因表达技术构建高效表达rhPC的HEK293细胞系。同时,拟从表达调控元件着手,优化逆转录病毒载体、提高逆转录病毒表达系统的效率。将绿色荧光报告基因EGFP构建到逆转录病毒载体PQCXIN中,用逆转录病毒载体PQCXIN/EGFP和包膜蛋白质粒pVSV-G共转染包装细胞GP2-293,获得感染滴度达到1.61×107GTU/ml的PQCXIN/EGFP重组病毒。分别用PQCXIN/EGFP病毒感染和pcDNA3.1/EGFP质粒转染HEK293细胞和CHO-K1细胞,采用流式细胞仪分析EGFP阳性细胞的相对荧光强度,PQCXIN/EGFP病毒感染获得的EGFP阳性细胞的相对荧光强度约为pcDNA3.1/EGFP质粒转染的EGFP阳性细胞的相对荧光强度的2倍。逆转录病毒的感染滴度和感染效率是影响逆转录病毒载体介导外源基因表达效率的重要因素。采用分步转染法,即先用逆转录病毒载体PQCXIN/EGFP转染GP2-293细胞,再用pVSV-G转染EGFP表达效率较高的GP2-293细胞,能在一定程度上提高PQCXIN/EGFP病毒的感染滴度。浓度为4～8μg/ml的聚凝胺有利于提高细胞对PQCXIN/EGFP病毒的敏感性、提高感染效率。以EGFP的荧光强度为评价指标,考察PQCXIN/EGFP病毒多轮感染HEK293细胞对EGFP表达效率的影响。经过4轮PQCXIN/EGFP病毒感染的HEK293细胞的EGFP表达水平比只经1轮PQCXIN/EGFP病毒感染的HEK293细胞提高了3.5倍左右。同时,经4轮病毒感染获得的混合克隆在多次传代后的EGFP表达水平只降低了22%;经pcDNA3.1/EGFP质粒转染的HEK293细胞混合克隆在多次传代后的EGFP表达水平下降了69%。结果表明,PQCXIN/EGFP病毒的反复多轮感染能有效地提高感染细胞的EGFP表达水平和稳定性。将rhPC基因替换EGFP基因,进一步比较PQCXIN/rhPC病毒感染和pcDNA3.1/rhPC质粒转染HEK293细胞的外源基因表达效果。重组病毒PQCXIN/rhPC感染得到的HEK293细胞的rhPC表达水平为326.4ng/106cells/day, pcDNA3.1/ rhPC质粒转染HEK293细胞的rhPC表达水平仅为8.6ng/106cells/day。用EGFP基因代替病毒载体PQCXIN/rhPC中的neo基因,通过IRES与rhPC基因连接,构建PQCXIN/rhPC/EGFP载体,使EGFP和rhPC的表达水平形成关联。借助流式细胞仪分选EGFP表达水平较高的细胞,经克隆化和ELISA检测筛选高效表达rhPC的HEK293细胞,获得了rhPC表达水平为10.7μg/106cells/day的HEK293细胞系。为了进一步提高逆转录病毒表达系统的效率,以EGFP为报告基因,采用质粒载体pcDNA3.1考察包括启动子、增强子、位置效应元件和RNA稳定元件等在内的表达调控元件对EGFP表达效率的影响。转染含RNA稳定与输出元件RESE的质粒载体pcDNA3.1 (pcDNA3.1/EGFP/RESE)的HEK293细胞的EGFP的表达水平提高了1.58倍。进一步通过tPA、Pro-uk和rhPC验证RESE的作用,RESE均不同程度地提高了tPA、Pro-uk和rhPC的表达效率。其中,rhPC的表达水平提高了近5倍,并经过单克隆化得到了表达水平为16.9μg/106cells/day的HEK293细胞系。将RESE构建到病毒载体中,RESE对逆转录病毒载体介导的外源基因表达效率的影响的考察仍在进行中。以上研究结果不仅表明逆转录病毒介导的外源基因表达系统是一种极具发展和应用潜力的外源基因高效表达系统。同时也为rhPC的开发研究打下了一定的基础。

全文目录

缩略语  4-5
中文摘要  5-7
英文摘要  7-10
前言  10-13
材料  13-17
  一细胞及细菌菌株培养  13
  二培养基  13
  三常用缓冲液及试剂  13-15
  四工具酶  15
  五试剂盒  15-16
  六主要生化试剂  16
  七主要仪器  16-17
方法  17-23
  1 细胞复苏  17
  2 细胞传代  17
  3 细胞冻存  17
  4 细胞计数  17
  5 细胞基因组 DNA 提取  17
  6 质粒提取  17
  7 凝胶 DNA 回收  17
  8 溶液 DNA 回收  17-18
  9 PCR 反应  18
  10 末端加 A  18
  11 连接酶切后的基因和质粒  18
  12 感受态制备  18-19
  13 E.coli 转化  19
  14 质粒及菌种的保存  19
  15 细胞转染  19
  16 病毒的制备和浓缩  19-20
  17 病毒滴度测定  20
  18 tPA 和 Pro-uk 活性测定  20-21
  19 利用流式细胞仪分析细胞中 EGFP 表达强度  21
  20 ELISA  21
  21 SDS PAGE  21
  22 Western Blot  21-22
  23 使用 STREAMLINE SP 阳离子柱纯化 rhPC  22-23
结果  23-52
  一基于逆转录病毒载体的表达系统的建立和评价  23-32
    1 重组逆转录病毒载体 PQCXIN/EGFP 的构建  23-24
    2 含 EGFP 的重组病毒的制备  24
    3 逆转录病毒载体系统表达 EGFP 的效果  24-29
    4 逆转录病毒载体系统表达 rhPC 的评价  29-32
  二高表达 rhPC 的细胞系的筛选和 rhPC 的纯化鉴定  32-37
    1 重组病毒载体 PQCXIN/rhPC/EGFP 的构建  32-33
    2 rhPC 高表达细胞系的筛选  33-34
    3 rhPC 的纯化鉴定  34-37
  三表达调控元件对逆转录病毒载体的优化  37-52
    1 表达调控元件的克隆  37-38
    2 表达调控元件在质粒载体中的验证  38-50
    3 含 RESE 的病毒载体的构建  50-52
讨论  52-57
  一逆转录病毒系统  52-53
  二表达调控元件  53-55
  三 HEK293 细胞系  55-57
总结  57-58
参考文献  58-60
综述  60-69
个人简历  69-70
致谢  70

基于逆转录病毒载体的高效表达系统的建立和应用

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