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三株木霉的鉴定和生物学特性及对华山松疱锈的防治研究

作　者: 周利
导　师: 陈玉惠
学　校: 西南林学院
专　业: 森林保护学
关键词: 重寄生木霉分类鉴定生物学特性细胞壁降解酶生物防治试验
分类号: S769
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

华山松(Pinus armandii Franch)是我国的特有树种,也是我国西部中山至亚高山地区以及长江中上游防护林体系的重要造林树种之一,近十余年因疱锈病危害,材积生长下降、木材力学性质发生劣变降低其工艺价值。病原茶藨生柱锈菌(Cronartium ribicola J.C Fischer)所具有的复杂的生活史和转主寄主的大量存在,给防治工作造成了极大的困难,从拮抗菌、重寄生菌以及促生菌中开发生防杀菌剂是生物防治研究的热点话题。《洱源枝顶孢侵染华山松疱锈菌机理研究》课题组在过去的研究中筛选出了3株对华山松疱锈病原菌具有强烈破坏作用的木霉菌,并证实它们能通过产生细胞壁降解酶——几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶来破坏锈孢子。本研究在对3株木霉(菌株号为:TR1、TR2、TR3)分类鉴定的基础上,对其进行了生物学特性和粗酶酶学基本性质的研究,并对其中2株木霉(TR1和TR2)对华山松疱锈病感病植株的控制效果进行了室内外初步研究,为利用其作为生防菌剂推广应用于实践生产提供理论依据。本设计的主要研究结果如下:(1)TR1在PDA上的培养性状与TR2、TR3明显不同,在3-5代后培养性状发生变异。依据显微特征,结合初期培养性状将其鉴定为酷绿木霉Trichoderma atroviride P. Karsten。TR2和TR3的培养性状与显微特征极为相似,为绿色木霉T. viride Pers ex Fr.。3株菌的rDNA-ITS序列分析及同源性比较结果显示,TR2和TR3序列完全相同,并且和T. viride的ITS序列具有100%的同源性。TR1和T. atroviride的ITS序列具有100%的同源性。形态特征和分子水平鉴定结果一致:TR1为T. atroviride。TR2和TR3为T. viride。(2)生物学特性:3株木霉的分生孢子在水琼脂、葡萄糖、PDA、改良Fries、华山松树皮浸汁和锈孢子培养基上均能萌发,以TR1在各种培养基上的萌发率最高,萌发速度最快;TR2和TR3在水琼脂和葡萄糖培养基上的萌发较差。3个菌株孢子萌发的最适温度范围为20℃～25℃,最适pH值为4.0～5.0,TR1在相对湿度(RH)大于65%,TR2和TR3在RH大于50%时,孢子萌发较好。但在90%～100% RH时,TR1的孢子萌发率高于TR2和TR3。黑暗和光暗交替能刺激TR1孢子萌发,连续光照则有利于TR2和TR3孢子的萌发。TR1和TR2菌丝生长最佳营养组合均为大麦粉、黄豆粉、KH2PO4;最适pH值和摇床速度相同,分别为pH6.0和120 r/min;TR1在温度25℃～30℃,水势-2.32 Mpa,接种量5%时菌丝生长量最大。TR2在温度20℃～25℃,水势为-4.54 Mpa,接种量为5%～9%的条件下菌丝生长最好;光照能明显刺激TR1和TR2分生孢子的产生,尤以对TR2的作用最为明显。酷绿木霉(TR1)作为重寄生菌、生防菌为国内外首次报道,对其生物学特性的研究也属首次。(3)酶学基本性质:2株菌所产β-1,3-葡聚糖酶最适温度均为35℃,45℃以下范围内具有较高的稳定性;TR1和TR2的β-1,3-葡聚糖酶最适pH分别为4.0和5.0 ,酸碱稳定范围分别为pH 3.0～6.0和pH 3.0～5.0,Km值分别为43.82μg/ml和71.28μg/ml;Ca2+是其共同的激活剂,Cu2+、Fe3+、Al3+为其共同的抑制剂。2株菌所产几丁质酶粗酶的酶学性质存在一定差异,TR1在40℃时酶活最高,TR2则在30℃～50℃范围内酶均具较高活性,最适温度范围较宽;此外,TR2所产几丁质酶的热稳定性高于TR1。2株菌所产几丁质酶的酸碱稳定范围相同,为pH4.0～6.0;最适pH值分别为6.0和5.0。Km分别为92.49μg/ml和71.11μg/ml。Mn2+和Ca2+是2株菌几丁质酶共同的激活剂。Cu2+、Fe3+等对2株菌几丁质酶均有不同程度的抑制作用,其中以Cu2+的抑制作用最强。(4)不同接种体对华山松疱锈感病枝干的室内控制:2株菌的分生孢子和菌丝段均能在华山松感病部位的锈子器上定殖和生长,引起锈孢子壁或疣突脱落,锈孢子死亡;粗酶液处理后同样使锈孢子壁或疣突脱落而死亡,3种接种体的处理结果相同,说明这2株生防木霉主要是通过细胞壁降解酶破坏锈孢子的。3种接种体对华山松疱锈均具控制作用。(5)病株防治范围的确定:通过组织切片从两种不同染色方法中筛选出了较易检查锈菌菌丝和吸器的染色方法并采用此法检测出茶藨生柱锈菌集中分布在罹病植株干、枝的皮部,枝梢及针叶组织未见菌丝和吸器出现,分布范围为病斑及其以上20 cm、以下15 cm范围内。(6)利用TR1、TR2活菌体对感病华山松植株的野外控制试验说明,木霉能够定殖在华山松疱锈病罹病植株的病部锈子器上。在经这2株重寄生菌防治的样地中,处理后的发病株均少于处理前,TR1在出性子器阶段防治一次的平均防效为53.7%。用TR2连续防治2年的防效最好可达100%,其中位于山腰样地的平均防效为99.1%,而沟边发病较重的各样地内平均防效也达91.5%。这说明TR1和TR2都是具有潜力的生防菌株。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
1 前言  12-25
  1.1 五针松疱锈病防治研究进展  13-15
    1.1.1 营林措施  13
    1.1.2 化学防治  13-14
    1.1.3 抗病育种  14
    1.1.4 生物防治  14-15
  1.2 拮抗微生物在植物病害可持续控制中的应用  15-20
    1.2.1 植物病害防治中拮抗微生物的种类  16-17
    1.2.2 有关木霉作为拮抗菌的研究  17-20
  1.3 细胞壁降解酶类的抗病机制及应用研究  20-24
    1.3.1 β-1,3-葡聚糖酶  21-22
    1.3.2 几丁质酶  22-23
    1.3.3 β-1,3-葡聚糖酶与几丁质酶的协同增效作用  23-24
    1.3.4 蛋白酶  24
  1.4 本研究的目的及意义  24-25
2 三株重寄生木霉的形态鉴定及rDNA-ITS 序列分析  25-31
  2.1 材料与方法  25-27
    2.1.1 木霉菌株  25
    2.1.2 形态鉴定  25
    2.1.3 rDNA-ITS 序列分析  25-27
  2.2 结果与分析  27-29
    2.2.1 三株木霉的形态特征及种类鉴定  27-28
    2.2.2 ITS 序列分析及种类鉴定  28-29
  2.3 结论与讨论  29-31
3 三株重寄生木霉的生物学特性研究  31-53
  3.1 材料与方法  31-35
    3.1.1 供试菌株与锈孢子  31
    3.1.2 培养基  31
    3.1.3 培养方法  31-32
    3.1.4 分生孢子萌发的生物学特性研究  32-33
    3.1.5 菌丝生长及产孢的生物学特性研究  33-35
  3.2 结果与分析  35-51
    3.2.1 分生孢子萌发的生物学特性  35-38
    3.2.2 菌株生长及产孢条件单因素筛选  38-50
    3.2.3 菌丝生长正交实验  50-51
  3.3 结论与讨论  51-53
4 TR1 和TR2 细胞壁降解酶酶学基本性质研究  53-67
  4.1 材料与方法  53-57
    4.1.1 培养基  53
    4.1.2 锈孢子壁的制备（冻融法）  53-54
    4.1.3 培养方法  54
    4.1.4 粗酶液的制备  54
    4.1.5 酶活性检测  54-56
    4.1.6 粗酶反应液体系  56
    4.1.7 粗酶液的基本性质  56-57
  4.2 结果与分析  57-64
  4.3 结论与讨论  64-67
5 TR1 和TR2 对华山松疱锈的防治试验  67-82
  5.1 不同接种体对华山松疱锈病的室内控制  67-70
    5.1.1 材料与方法  67-68
    5.1.2 结果与分析  68-70
  5.2 野外防治试验  70-80
    5.2.1 病部防治范围的确定  70-74
    5.2.2 防治试验  74-80
  5.3 结论与讨论  80-82
    5.3.1 室内防治实验  80
    5.3.2 野外防治试验  80-82
6 结论与展望  82-85
  6.1 结论  82-83
    6.1.1 形态分类及rDNA-ITS 序列分析  82
    6.1.2 生物学特性  82
    6.1.3 酶学基本性质  82-83
    6.1.4 室内外防治试验  83
  6.2 展望  83-85
参考文献  85-94
致谢  94-95
附录  95-96

三株木霉的鉴定和生物学特性及对华山松疱锈的防治研究

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