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小鹅瘟单克隆抗体的研制及应用研究

作　者: 郑义华
导　师: 李锦春；李银
学　校: 安徽农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 鹅小鹅瘟病毒单克隆抗体 ELISA 诊断
分类号: S855
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

小鹅瘟是一种传播快、死亡率高的传染病。由于其病情急、病程短,因此,早发现、早治疗对控制本病十分重要。近年来,小鹅瘟病多继发其他疾病或与其他传染性疾病并发,其临床症状和病理解剖都缺乏特征性,这样就给疾病的诊断和防治造成巨大困难,必须通过试验室诊断方可确诊。目前实验室诊断方法有病毒的分离鉴定、琼脂扩散试验、聚合酶链式反应等数种,它们或存在耗时长、敏感性低,或存在设备昂贵等缺点。酶联免疫吸附试验（ELISA）方法具有方便、敏感和快速的特点,可以直接检测出病料中的小鹅瘟病毒,但是由于其超敏感的特点,也易造成假阳性和假阴性结果,只有用纯化的抗原或者抗体,才可以避免假阳性和假阴性的结果出现。与上述几种实验室诊断方法相比,酶联免疫吸附试验（ELISA）对仪器设备要求不高,临床上容易做到,如果利用纯化的抗原或者抗体便可以避免假阳性和假阴性的结果出现,单克隆抗体便可弥补这个缺陷。与常规抗体相比,单克隆抗体纯度更高,特异性更好,并且一经研制出,便可大量地生产。如使用酶标单克隆抗体来进行ELISA试验以鉴定小鹅瘟病毒,就可以将ELISA方法和单抗的优点结合起来,为快速、准确诊断小鹅瘟探索一种新方法。这便是本论文目的所在。由于ELISA试验结果受试验工作条件影响很大,而文献报道的试验条件不尽一致。本文首先对间接ELISA的各步工作条件进行了比较和筛选,建立了稳定、可靠的ELISA检测方法。其次,通过淋巴细胞融合技术,以50%PEG（分子量3350）作为融合剂,将以GPV程序化免疫的BALB/C小鼠脾细胞和肿瘤细胞系SP2/0细胞融合。通过间接ELISA试验筛选出阳性细胞,扩大培养并亚克隆。最后研制出6株抗小鹅瘟病毒（GPV）杂交瘤细胞,分别命名为2A6A9、4C7C5、1H3H5、4E3D9、2A9H1和3G1D5。以杂交瘤细胞阳性株注射BALB/C小鼠制取腹水后测定其效价达10^-5。以间接ELISA法测定单克隆抗体特异性,鉴定单克隆抗体亚类,结果表明所得到的均为IgG1型单抗,并且特异针对小鹅瘟病毒。测定冻存前和冻存后20天杂交瘤细胞上清液间接ELISA效价,通过效价的变化,评价所获得的杂交瘤细胞对于冻存的稳定性,结果表明杂交瘤细胞对于冻存有较好的稳定性。最后,利用获得的抗小鹅瘟单克隆抗体与HRP交联,建立了快速、特异检测小鹅瘟病毒的间接夹心ELISA法。用得到的辣根过氧化物标记的单抗做ELISA以检测GPV、NDV、AI-H9和DHV,结果表明抗小鹅瘟病毒的单抗与NDV、AIV-H9、DHV病毒不反应,仅与本实验的GPV毒株反应。说明用该方法诊断小鹅瘟病毒具有良好的特异性。用得到的辣根过氧化物标记的单抗做双抗夹心ELISA以检测健康、人工发病和自然发病鹅的组织样品,并做鹅胚接种-病理观察-琼脂扩散试验作为对照。结果表明:用辣根过氧化物标记的单抗ELISA法,24h即检测出小鹅瘟病毒,检出时间明显短于鹅胚死亡时间（P＜0.05）;且该方法可以检测出更多的器官中的病毒,也可以检测出弱毒性病毒。这些结果表明该方法有利于快速、特异性检测小鹅瘟病毒,具有良好的应用前景。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-9
缩略语  9-10
文献综述  10-19
  1 小鹅瘟概况  10-13
    1.1 病原  10-11
      1.1.1 病毒分类  10
      1.1.2 病毒结构特征  10-11
    1.2 流行病学  11
    1.3 临床症状  11
    1.4 病理变化  11-12
    1.5 防制  12-13
  2 小鹅瘟实验室诊断技术  13-16
    2.1 病毒的分离鉴定  13
    2.2 血清学方法  13-15
      2.2.1 琼脂扩散试验(APG)  13-14
      2.2.2 对流免疫电泳法  14
      2.2.3 精子凝集试验  14
      2.2.4 反向间接血凝试验  14
      2.2.5 病毒中和试验(VN)  14-15
      2.2.6 免疫荧光诊断法  15
      2.2.7 酶联免疫吸附试验(ELISA)  15
    2.3 分子生物学方法  15-16
      2.3.1 聚合酶链式反应(PCR)  15-16
      2.3.2 核酸探针法  16
  3 单克隆抗体研究进展  16-19
引言  19-21
正文  21-40
  1 材料与方法  21-30
    1.1 试验材料  21-22
      1.1.1 试剂  21-22
      1.1.2 主要仪器  22
      1.1.3 试验动物及细胞  22
    1.2 单抗制备和性质鉴定  22-29
      1.2.1 筛选阳性杂交瘤细胞的间接ELISA方法的建立  22-24
      1.2.2 免疫抗原制备、动物免疫  24-25
      1.2.3 细胞融合  25-26
      1.2.4 阳性细胞株的筛选和亚克隆  26-27
      1.2.5 杂交瘤细胞的染色体分析  27
      1.2.6 细胞冻存和复苏方法  27-28
      1.2.7 腹水的制备  28
      1.2.8 单抗效价的测定  28
      1.2.9 单抗免疫球蛋白的类别和亚类鉴定  28
      1.2.10 单克隆抗体的特异性测定  28
      1.2.11 单克隆抗体的稳定性测定  28-29
      1.2.12 抗体的纯化  29
    1.3 单抗的应用  29-30
      1.3.1 酶标记  29
      1.3.2 ELISA法特异性鉴定  29-30
      1.3.3 组织样处理  30
      1.3.4 不同检测方法的比较  30
  2 结果与分析  30-36
    2.1 杂交瘤细胞的制备和性质鉴定  30-34
      2.1.1 阳性杂交瘤细胞筛选方法的建立  30-32
      2.1.2 细胞融合结果  32
      2.1.3 杂交瘤细胞腹水效价  32-33
      2.1.4 单克隆抗体的特异性  33
      2.1.5 抗原亚类分析  33-34
      2.1.6 单抗稳定性  34
      2.1.7 杂交瘤细胞染色体计数结果  34
    2.2 单抗的应用研究  34-36
      2.2.1 特异性检测结果  34-35
      2.2.2 不同检测方法的比较  35-36
  3 讨论  36-40
    3.1 单克隆抗体研制和单抗性质研究  36-38
    3.2 单克隆抗体的应用  38-40
结论  40-41
参考文献  41-45
附录  45-47
致谢  47-48
作者简介  48

小鹅瘟单克隆抗体的研制及应用研究

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