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siRNA干扰SOCS3表达对TNF-α诱导前体脂肪细胞凋亡的影响

作　者: 解芸菲
导　师: 孙超
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 细胞生物学
关键词: TNF-α SOCS3 3T3-L1前体脂肪细胞小鼠前体脂肪细胞 STAT3
分类号: Q255
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

脂肪细胞不仅是机体能量的主要贮存和释放场所,它还分泌多种细胞因子对其自身和其他细胞发挥重要的调节作用。TNF-α作为其中最早发现的分泌产物之一,它对脂肪细胞可产生多种效应,如抑制脂肪细胞生长,诱导前体脂肪细胞和脂肪细胞凋亡。但由于脂肪细胞自身的特点,TNF-α诱导脂肪细胞凋亡鲜有研究和报道。SOCS家族是JAK/STAT信号通路的负调控因子。JAK2/STAT3通路是多种细胞生长、存活、分化及凋亡功能发挥过程中重要的细胞内信号传导途径。本试验以3T3-L1前体脂肪细胞和小鼠前体脂肪细胞为研究对象,应用siRNA沉默SOCS3基因,研究其对TNF-α诱导的前体脂肪细胞凋亡的影响,主要研究结果如下:1.以20、40、60、80、100、150、200 ng/mL TNF-α处理3T3-L1前体脂肪细胞24 h,光学显微镜观察细胞的形态学变化。结果表明,TNF-α诱导3T3-L1前体脂肪细胞凋亡呈剂量依赖性。100 ng/mL TNF-α处理后,3T3-L1前体脂肪细胞出现明显的细胞凋亡,并伴随出现细胞体积缩小,染色质凝集,核质固缩等特征。2.采用siRNA干扰技术,成功干扰SOCS3基因的表达,其中SOCS3 siRNA1基因沉默效果最明显,在3T3-L1前体脂肪细胞和小鼠前体脂肪细胞中SOCS3 mRNA表达分别下降了57%和50%,为后续以SOCS3基因为靶点的研究工作奠定基础。3. siRNA沉默3T3-L1前体脂肪细胞中SOCS3基因后,100 ng/mL TNF-α处理24 h,采用Hoechst 33258和PI染色剂染色,荧光显微镜观察细胞的形态学变化。RT-PCR和Western Blotting方法检测凋亡相关基因c-myc、survivin、mcl-1、bcl-2、bax、NF-κB和JAK2/STAT3通路关键基因SOCS1、SOCS2、JAK2、STAT3的mRNA和蛋白的表达变化。结果表明,与对照组相比,沉默SOCS3表达后细胞凋亡数量明显减少;survivin和NF-κB mRNA表达显著上升(P<0.05),c-myc和bcl-2 mRNA表达极显著上升(P<0.01),bax和SOCS1 mRNA表达显著下降(P<0.05),而mcl-1 mRNA表达无显著变化(P>0.05);Western blotting检测发现,p-STAT3蛋白表达显著上升(P<0.05),Bcl-2和NF-κB蛋白表达极显著上升(P<0.01),Bax蛋白表达显著下降(P<0.05)。而脂质体组和阴性对照组中各基因、蛋白的表达与空白对照组之间均无显著变化。结果表明,沉默SOCS3通过调控JAK2/STAT3通路关键基因和凋亡相关基因的表达,显著抑制了TNF-α诱导的3T3-L1前体脂肪细胞凋亡。4. siRNA沉默小鼠前体脂肪细胞中SOCS3基因后,100 ng/mL TNF-α处理24 h,Hoechst 33258和PI染色发现,沉默SOCS3表达后细胞凋亡数量明显减少;RT-PCR检测证明,NF-κB mRNA表达显著上升(P<0.05),mcl-1和bcl-2 mRNA表达极显著上升(P<0.01),SOCS1 mRNA表达极显著下降(P<0.01),而bax、c-myc和survivin mRNA表达无显著变化(P>0.05);Western blotting检测发现,Bcl-2、NF-κB和p-STAT3蛋白表达极显著上升(P<0.01),Bax蛋白表达显著下降(P<0.05)。结果表明,沉默SOCS3通过JAK2/STAT3通路调控了凋亡相关基因的表达,从而显著抑制了TNF-α诱导的小鼠前体脂肪细胞凋亡。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-12
文献综述  12-23
  第一章 TNF-α与脂肪细胞生物学的研究现状  12-18
    1.1 TNF-α简述  12-13
    1.2 TNF-α在脂肪细胞中的作用机制  13-14
    1.3 TNF-α在脂肪细胞中的生物学功能  14-18
      1.3.1 TNF-α对脂肪细胞中胰岛素抵抗的影响  14
      1.3.2 TNF-α对脂肪细胞内分泌的影响  14-15
      1.3.3 TNF-α对脂肪细胞中脂质代谢的影响  15-16
      1.3.4 TNF-α对脂肪细胞分化的影响  16
      1.3.5 TNF-α对棕色脂肪组织和产热的影响  16-18
  第二章 JAK2/STAT3 通路与癌细胞及其凋亡的研究现状  18-23
    2.1 STAT3 与癌细胞及其凋亡的研究现状  18-22
      2.1.1 STAT3 与肿瘤及癌细胞的关系  18-21
      2.1.2 STAT3 对癌细胞存活和凋亡的影响  21-22
    2.2 SOCS 与癌细胞及其凋亡的研究现状  22-23
试验研究  23-43
  前言  23-24
  第三章 siRNA 干扰SOCS3 表达对TNF-α诱导3T3-L1 前体脂肪细胞凋亡的影响  24-36
    3.1 材料与方法  24-29
      3.1.1 材料  24
      3.1.2 方法  24-29
    3.2 结果与分析  29-34
      3.2.1 TNF-α对3T3-L1 前体脂肪细胞凋亡的影响  29-30
      3.2.2 siRNA 转染效率的筛选  30
      3.2.3 阳性对照检测siRNA 试剂对β-actin 的干扰情况  30-31
      3.2.4 siRNA 对SOCS3 基因表达的影响  31
      3.2.5 SOCS3 siRNA 对TNF-α诱导3T3-L1 前体脂肪细胞凋亡的形态学观察  31-32
      3.2.6 SOCS3 siRNA 对 3T3-L1 前体脂肪细胞凋亡中凋亡相关基因和蛋白表达的影响  32-33
      3.2.7 SOCS3 siRNA 对 3T3-L1 前体脂肪细胞凋亡中 JAK2/STAT3 通路关键基因和蛋白表达的影响  33-34
    3.3 讨论  34-36
  第四章 siRNA 干扰SOCS3 表达对TNF-α诱导小鼠前体脂肪细胞凋亡的影响  36-43
    4.1 材料与方法  36-38
      4.1.1 材料  36-37
      4.1.2 方法  37-38
    4.2 结果与分析  38-41
      4.2.1 siRNA 对SOCS3 基因表达的影响  38
      4.2.2 SOCS3 siRNA 对TNF-α诱导小鼠前体脂肪细胞凋亡的形态学观察  38-39
      4.2.3 SOCS3 siRNA 对小鼠前体脂肪细胞凋亡中凋亡相关基因和蛋白表达的影响  39-40
      3.2.4 SOCS3 siRNA 对小鼠前体脂肪细胞凋亡中 JAK2/STAT3 通路关键基因和蛋白表达的影响  40-41
    4.3 讨论  41-43
结论  43
创新点  43
进一步研究内容  43-44
缩略词表  44-45
参考文献  45-52
致谢  52-53
作者简介  53

siRNA干扰SOCS3表达对TNF-α诱导前体脂肪细胞凋亡的影响

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