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P21蛋白在牛卵成熟过程中作用的初步研究

作　者: 赵贵民
导　师: 雷安民
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 临床兽医学
关键词: P21 减数分裂卵母细胞成熟牛
分类号: Q813.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 15次
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内容摘要

在哺乳动物卵子减数分裂调控中,MPF(CDK1-Cyclin B1)的活性变化起着关键性作用。P21蛋白是最早被发现并证实具有CKIs作用的Cip/Kip家族成员,在低等动物卵子中已经证实P21可以直接的抑制CDK1激酶Thr-161位点的磷酸化,从而抑制MPF的活性,但是P21在哺乳动物卵母细胞减数分裂调控中的作用尚未报道,这就是本研究关注的核心问题。本研究以牛卵母细胞为试验材料,首先利用地衣红染色技术观察了牛卵母细胞体外成熟以及减数分裂到有丝分裂转换过程中各个时期染色体的形态学变化,确定了牛卵母细胞各时期的具体时间段;其次从牛成纤维细胞中克隆了p21基因,并构建了pVenus-P21真核表达载体;最后运用Q-PCR和免疫荧光染色技术检测了P21在牛卵中的表达与定位,通过超表达与干扰P21蛋白初步研究了P21在M-I期和M-II期中的功能。研究取得以下结果:1.通过地衣红染色系统地观察了牛卵母细胞体外成熟过程中染色体的形态学变化特征,据此确定不同培养时间段中卵母细胞所处的细胞周期时相,建立了牛卵母细胞体外培养过程中染色体变化规律的时间进程表,即在体外培养0~5.45 h,11.40 h,13.15 h,17.10 h,18.35~24 h,大部分卵母细胞分别处于GV期、GVBD~pre-M-I期、M-I期、A-I期、T-I期、M-II期。然后比较了三种化学激活方法(Ionomycin单独使用,Ionomycin联合6-DMAP,Ionomycin联合Roscovitine)对牛卵第二极体排出以及原核形成的影响,发现Ionomycin单独使用或联合Roscovitine使用时,2 h后就有大量第二极体排出,在孤雌激活8 h后就有原核形成,在孤雌激活后16~18 h原核形成数达到最高;而应用Ionomycin联合6-DMAP使用时,会抑制第二极体的的排出;Ionomycin联合Roscovitine同样能达到Ionomycin联合6-DMAP孤雌激活牛卵的原核数。2.利用RT-PCR技术成功从牛成纤维细胞中克隆得到p21基因的CDS全长序列,经与NCBI上公布的p21序列对比,同源性为100%。将其连接到pVenus真核表达载体上成功构建了pVenus-P21真核表达载体,转染Hela细胞及其体外转录的cRNA显微注射卵母细胞后均能正确表达和准确定位。3.在mRNA水平上分别检测了不同组织以及卵母细胞与胚胎发育过程中p21的表达,并对结果进行了分析。结果表明,p21在颗粒细胞中表达较高;在卵母细胞成熟过程中的M-II期表达相对较高;在胚胎发育的不同阶段,以囊胚中p21 mRNA表达量为最高。此外,P21蛋白在卵母细胞核内分布远较细胞质丰富,表明P21具有核定位特性。在卵母细胞成熟过程中P21可以阻止卵子进入M-I期,同时促进卵母细胞从M-II期退出。本研究得到如下结论:建立了牛卵母细胞体外成熟培养过程中染色体形态变化的时间进程表;P21在卵母细胞成熟各时期中均有表达,P21定位在染色体及周围结构上;P21阻止卵母细胞进入M-I期,但促进卵子从M-II期退出。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-13
第一部分：文献综述  13-45
  第一章哺乳动物卵子减数分裂调控的分子机制  13-27
    1.1 第一次减数分裂双线期的阻滞与恢复  14-19
      1.1.1 双线期的阻滞  14-17
      1.1.2 双线期阻滞的恢复  17-19
    1.2 M-I 期的阻滞与恢复  19-21
      1.2.1 SAC  19-21
      1.2.2 Mos/MAPK 通路  21
      1.2.3 ROS  21
    1.3 M-II 期的阻滞与退出  21-24
      1.3.1 CSF  21
      1.3.2 Cyclin B 的动态平衡系统  21-22
      1.3.3 APC/C 介导的蛋白酶体降解系统  22-23
      1.3.4 Mos/MEK/MAPK 通路  23-24
      1.3.5 纺锤体组装系统  24
      1.3.6 ROS  24
    1.4 减数分裂细胞周期阻滞在M-III 期  24-27
  第二章细胞周期抑制蛋白P21 的研究进展  27-45
    1.1 P21 蛋白的发现与命名  28
    1.2 P21 蛋白质的结构  28-29
    1.3 P21 的生物学功能  29-33
      1.3.1 P21 在细胞周期调控中的作用  29-31
      1.3.2 P21 在细胞凋亡中的作用  31-32
      1.3.3 P21 在DNA 损伤修复中的作用  32
      1.3.4 P21 在细胞衰老和老化中的作用  32-33
      1.3.5 P21 在iPS 细胞重编程中的作用  33
    1.4 P21 的表达调控  33-42
      1.4.1 P21 的转录调控  33-37
      1.4.2 p21 m RNA 转录后的调控  37-40
      1.4.3 P21 蛋白翻译后的调控  40-42
    1.5 P21 在卵子成熟过程中作用的研究进展  42-45
      1.5.1 P21 在卵母细胞成熟与胚胎发育过程中的表达研究进展  42
      1.5.2 P21 在卵子成熟过程中作用的研究进展  42-45
第二部分：试验研究  45-86
  第三章牛卵母细胞体外成熟减数分裂核进程的研究  45-59
    3.1 材料和方法  45-49
      3.1.1 仪器设备  45-46
      3.1.2 主要试剂及培养液的配制  46
      3.1.3 试验材料  46
      3.1.4 牛卵母细胞的收集  46-47
      3.1.5 牛卵母细胞的体外成熟培养  47
      3.1.6 颗粒细胞的原代培养及饲养层的制备  47
      3.1.7 牛卵母细胞的孤雌激活及体外培养  47
      3.1.8 牛卵母细胞地衣红染色  47-48
      3.1.9 牛卵母细胞GV 期到M-II 期核进程的时间分析  48
      3.1.10 牛卵母细胞孤雌激活后减数分裂到有丝分裂核进程的时间分析  48
      3.1.11 卵母细胞染色体扩散方法  48-49
    3.2 结果与分析  49-56
      3.2.1 牛卵GV 期到M-II 期染色体形态学变化的观察  49-52
      3.2.2 牛卵GV 期到M-II 期核进程的时间分析  52-53
      3.2.3 牛卵减数分裂到有丝分裂转换过程中染色体形态学观察  53-54
      3.2.4 不同的化学激活剂对第二极体的排出和原核形成的影响  54-55
      3.2.5 牛卵减数分裂到有丝分裂转换期间核进程的时间分析  55-56
    3.3 讨论  56-58
    3.4 小结  58-59
  第四章 p21 基因的克隆及其真核表达载体构建  59-71
    4.1 材料与方法  59-62
      4.1.1 仪器设备  59-60
      4.1.2 材料和试剂  60
      4.1.3 PCR 扩增p21 基因及序列鉴定  60-61
      4.1.4 P21 真核表达载体构建  61
      4.1.5 pVenus-P21 转染Hela 细胞  61-62
      4.1.6 RT-PCR 鉴定pVenus-P21 在Hela 细胞表达情况  62
      4.1.7 体外转录及cRNA 显微注射  62
    4.2 结果与分析  62-69
      4.2.1 牛p21 基因扩增及序列分析  62-63
      4.2.2 pVenus-P21 真核表达载体鉴定  63-64
      4.2.3 荧光显微镜观察重组质粒pVenus-P21 在Hela 细胞中的表达与定位  64-65
      4 2.4 RT-PCR 鉴定重组质粒pVenus-P21 的表达  65
      4.2.5 体外转录产物分析  65-67
      4.2.6 荧光显微镜下观察P21-Venus 融合蛋白在牛卵内的表达及定位  67-69
    4.3 讨论  69-70
    4.4 小结  70-71
  第五章 P21 蛋白在牛卵成熟过程中作用的初步研究  71-86
    5.1 材料与方法  71-74
      5.1.1 仪器设备  71-72
      5.1.2 材料和试剂  72
      5.1.3 牛卵母细胞的体外成熟及胚胎培养  72
      5.1.4 不同组织中p21 m RNA 定量表达检测  72-73
      5.1.5 牛卵体外成熟与胚胎发育不同阶段p21 m RNA 定量表达检测  73
      5.1.6 牛卵母细胞体外成熟各时期P21 蛋白免疫荧光染色  73
      5.1.7 GV 期超表达与干扰P21  73-74
      5.1.8 M-II 期超表达与干扰P21  74
      5.1.9 数据统计  74
    5.2 结果与分析  74-82
      5.2.1 在m RNA 水平上检测不同组织中p21 的表达  74-75
      5.2.2 在m RNA 水平定量分析牛卵体外成熟与胚胎发育不同时期p21 的表达  75-76
      5.2.3 在m RNA 水平定量分析牛卵体外成熟不同时期几个基因的表达  76-78
      5.2.4 牛卵母细胞P21 蛋白免疫荧光染色检测  78-79
      5.2.5 P21 对牛卵进入M-I 的影响  79-81
      5.2.6 P21 对牛卵M-II 退出的影响  81-82
    5.3 讨论  82-85
    5.4 小结  85-86
结论  86
本研究的创新点与进一步研究的课题  86-87
参考文献  87-99
缩略词  99-101
致谢  101-102
作者简介  102

P21蛋白在牛卵成熟过程中作用的初步研究

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