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绿藻基因转化体系的初步研究

作　者: 何建华
导　师: 何培民
学　校: 上海海洋大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: PEG转化缘管浒苔原始小球藻抗性筛选标记 PEPC
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本文分别以大型绿藻缘管浒苔（长石莼）和微藻（原始小球藻）为研究对象,对其基因工程油藻与转化体系的建立和优化进行了初步研究:1)产油微藻的筛选与分子鉴定;2)浒苔（石莼）与原始小球藻选择标记的筛选;3)工程藻株转化体系的建立;4)原始小球藻烯醇式丙酮酸羧化酶PEPC的克隆与原核表达,这些为今后建立缘管浒苔（长石莼）、原始小球藻遗传转化模型,实现藻类的资源化利用奠定了基础。首先,研究了微藻油脂的荧光检测方法与微藻的分子鉴定。利用尼罗红、BODIPY对油脂的特异性染色,初步建立起微藻的快速油脂检测技术,可以作为后续转基因效果的指标,也可以筛选适合的藻种。筛选出一株含油量为21.66±0.49%的小球藻,对筛选的藻种进行形态观察与分子鉴定,利用rbcL和ITS这两种进行标记进行鉴定,从而确认研究藻种是原始小球藻。其次,利用抗生素和除草剂对浒苔（石莼）和原始小球藻进行基因工程选择标记进行选择。除草剂（Basta）对缘管浒苔、浒苔、条浒苔三种浒苔小苗具有很强的致死作用,可以选择12.5μg/ml的除草剂（Basta）作为浒苔原生质体遗传转化体系的筛选标记。在不同生长时期不同藻株对除草剂Basta的耐受程度不同。而随着藻体的生长,藻体对Basta的耐受性不断增加,并且显示种属差异性,对Basta的敏感度依次为缘管浒苔、浒苔、条浒苔。通过研究原始小球藻对六种抗生素及除草剂（Basta）的敏感性,结合实验室拥有载体和经济成本,我们选择除草剂作为原始小球藻的抗性筛选标记。培养五天后,20μg/ml的除草剂便可把小球藻杀死,以便有良好的选择效果。再次,对绿藻基因转化体系进行了初步研究。小球藻的遗传转化模型比较成熟,已经建立起PEG、电击法、基因枪等方法,对我们研究具有很大借鉴意义。同时,在实验室原有基础上,对缘管浒苔（长石莼）的PEG方法进行改进优化,将构建的含有bar抗性筛选基因（启动子为SV40）的pSVB载体通过PEG法介导导入到Ulva linza原生质体中,通过细胞培养再生成株,在PH、PEG₆₀₀₀浓度、质粒含量方面进行优化,从而使相对转化率达到了38.58%。继续将含Basta VSE培养液对转化小苗进行压力筛选,并从中挑选出阳性藻株进行bar基因PCR分子检测,发现压力筛选1个月和12个月的转化藻体总DNA均得到了预期的阳性信号,其序列与GenBank中一致初步表明bar抗性筛选基因在启动子SV40作用下可在藻株中表达,最优转化条件是在终浓度为20%PEG₆₀₀₀,PH8.0条件下20μg质粒DNA转化2×105个原生质体细胞可以取得较好的效果,平均转换率为38.58%。最后,对原始小球藻的产油调控基因PEPC烯醇式丙酮酸羧化酶进行了克隆,并在核苷酸和氨基酸水平上对序列进行了生物信息学分析,此外进一步构建pGEX-4T-1-PEPC使其在大肠杆菌中表达。研究表明,原始小球藻的PEPC基因在大肠杆菌成功表达,并表现出生物活性。原始小球藻的PEPC基因在大肠杆菌中表达,转化菌株比野生菌株相比PEPC酶活性增加127%,蛋白质增加为空菌的130%,显著增加;而总脂则减少到原来的45.1%显著减少,从而验证了PEPC活性的增加控制碳源向蛋白质合成方向流动从而抑制了脂肪的合成。从而使蛋白质/脂肪比从3.3转化为9.8左右。从而也说明PEPC是控制体内蛋白质和脂肪含量调节的关键酶,为利用此基因构建基因工程微藻建立了基础。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-13
引言  13-21
第一章微藻的筛选与鉴定  21-38
  1. 材料与方法  22-27
    1.1 实验材料与试剂  22
    1.2 藻类分离与培养  22-23
    1.3 藻类的中性油脂染色方法  23
    1.4 显微镜下观察藻体细胞形态  23
    1.5 DNA 的提取与检测  23-24
    1.6 藻体rbcL 基因的扩增与 AT 克隆  24-26
    1.7 小球藻rbcL 基因的生物信息学分析  26
    1.8 藻体 ITS 基因的扩增与 AT 克隆  26
    1.9 小球藻 ITS 基因的生物信息学分析  26-27
  2. 结果与分析  27-36
    2.1 微藻的中性油脂荧光染色结果与分析  27-30
    2.2 微藻形态观察结果与分析  30
    2.3 DNA 的提取结果  30-31
    2.4 rbcL 基因的PCR 扩增、AT 克隆及检测  31-33
    2.5 藻体的rbcL 序列分析  33-34
    2.6 藻体的 ITS 序列克隆  34-35
    2.7 藻体的 ITS 序列分析  35-36
  3. 讨论  36-38
第二章：基因工程筛选标记的确定  38-50
  第一节：不同浒苔对除草剂的抗性筛选  38-42
    1. 材料与方法  38-40
      1.1 材料与藻种培养  38
      1.2 原生质体的获得  38-39
      1.3 原生质体的培养  39
      1.4 浒苔小苗对除草剂（Basta）的敏感性研究  39
      1.5 浒苔成体对除草剂（Basta）的敏感性研究  39-40
    2 结果及分析  40-41
      2.1 浒苔小苗对除草剂（Basta）的敏感性研究  40
      2.2 浒苔成体对除草剂（Basta）的敏感性研究  40-41
    3. 讨论  41-42
  第二节：原始小球藻基因工程筛选标记的确定  42-50
    1. 材料与方法  42-43
      1.1 材料与藻种培养  42
      1.2 原始小球藻的生长实验  42
      1.3 原始小球藻对6 种抗生素的敏感性的测定  42
      1.4 原始小球藻对氯霉素和除草剂（Basta）的敏感性研究  42-43
      1.5 不同浓度除草剂（Basta）对原始小球藻相对存活率的影响  43
    2 结果及分析  43-48
      2.1 原始小球藻的生长曲线  43
      2.2 六种抗生素对原始小球藻生长的影响  43-44
      2.3 氯霉素和除草剂对原始小球藻生长的影响  44-48
      2.4 不同浓度除草剂（Basta）对原始小球藻相对存活率的影响  48
    3. 讨论  48-50
第三章：工程藻株转化体系的建立  50-57
  1. 材料与方法  51-52
    1.1 材料  51
    1.2 藻类培养  51
    1.3 长石莼（缘管浒苔）原生质体制备  51
    1.4 长石莼（缘管浒苔）原生质体的 PEG 法转化  51-52
    1.5 转化长石莼（缘管浒苔）原生质体筛选  52
    1.6 长石莼（缘管浒苔）转基因植株 PCR 检测  52
  2 结果与分析  52-55
    2.1 酶解  52-53
    2.2 长石莼（缘管浒苔）原生质体PEG 转化方法优化  53-54
    2.3 转化植株筛选与 PCR 检测  54-55
  3 讨论  55-57
第四章原始小球藻 PEPC（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）基因的克隆与表达  57-69
  1. 材料与方法  58-62
    1.1 实验材料与试剂  58
    1.2 藻类培养  58
    1.3 原始小球藻总 RNA 的提取  58-59
    1.4 原始小球藻cDNA 合成  59-60
    1.5 原始小球藻 PEPC 基因部分序列的克隆  60
    1.6 原始小球藻 PEPC 基因序列生物信息分析  60-61
    1.7 原始小球藻 PEPC 基因原核表达载体的构建  61
    1.8 pGEX-4T-1-PEPC 基因在大肠杆菌中的诱导表达  61
    1.9 PEPC 酶活性检测  61-62
    1.10 大肠杆菌总蛋白、总脂的提取与分析  62
  2. 结果  62-67
    2.1 RNA 提取的结果  62-63
    2.2 PEPC 基因克隆产物的AT 克隆与测序  63
    2.3 PEPC 基因核苷酸序列系统树建立  63-64
    2.4 PEPC 氨基酸序列系统树建立  64-65
    2.5 原始小球藻 PEPC 基因原核表达载体的构建  65-66
    2.6 pGEX-4T-1-PEPC 基因在大肠杆菌中的诱导表达  66-67
    2.7 PEPC 酶活性检测  67
    2.8 大肠杆菌总蛋白、总脂的提取与分析  67
  3. 讨论  67-69
结论  69-70
参考文献  70-79
附录  79-81
攻读硕士学位期间科研工作情况  81-82
致谢  82

绿藻基因转化体系的初步研究

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