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转C_4光合酶基因水稻的光合特性及生理机制研究

作　者: 凌丽俐
导　师: 林宏辉
学　校: 四川大学
专　业: 植物学
关键词: 转基因水稻 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC) 丙酮酸磷酸二激酶(PPDK) NADP-苹果酸酶(NADP-ME) 光合特性 叶绿素荧光 光抑制 光氧化 杂交后代 花粉培育
分类号: S511
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


高等植物在光合类型上可分为C3、C4、CAM三大类。C4和CAM植物是在逆境条件下经过长期驯化，从C3植物进化而来的。与C3植物相比，C4植物由于具有CO2浓缩机制，能在高光强、高温及低浓度CO2、干旱等条件下，比C3植物有较高的光合速率和营养、水分利用效率。二十世纪末，随着转基因技术的快速发展，以农杆菌为介导已成功地将来自玉米编码C4光合途径关键酶PEPC，PPDK，NADP-ME的基因分别转入水稻中，获得了不同的高表达的转基因水稻材料。通过对C4途径有关光合酶活性、光合作用对光的响应和光抑制／光氧化条件下的叶绿素荧光特性等生理指标的比较，研究了转C4光合酶基因水稻的生理特性。转C4光合酶基因水稻中，其相应的酶活性确实得到了高表达。转PPDK、PEPC光合酶基因水稻的饱和光合速率比原种高，其中转PEPC基因水稻的光饱和点比原种高200μmol m-2s-1，饱和光合速率比原种高53．1％；而转ME基因水稻的饱和光合速率略低于原种。在高光强（3h）或光氧化剂甲基紫精（MV）处理后，与原种相比，转PEPC酶基因水稻的PSⅡ光化学效率（Fv／Fm）、实际光化学效率（FPSⅡ）和光化学猝灭（qP）下降得较少，证明其耐光抑制和耐光氧化能力增强。而转ME基因水稻的Fv／Fm、F PSⅡ和qP下降的幅度高于原种，表明其易遭受光抑制和光氧化伤害。进一步用杂交的方法将ME基因转入PEPC+PPDK双基因水稻，测定了不同转C4光合酶基因水稻的C4光合酶活性、光合速率以及活性氧代谢有关指标，发现原种中具有全套的C4光合酶，但活性很低，而不同转C4光合酶基因水稻高表达了相应的C4酶活性。在高光条件下，与原种相比较，转PPDK基因水稻的光合速率未增加；转ME基因水稻的光合速率降低了7．6％；转PEPC基因水稻的光合速率增加了52．1％，转PEPC+PPDK双基因水稻与转PEPC基因水稻相近。ATP处理后，可显著提高转PEPC+PPDK双基因水稻和转PEPC+PPDK+ME基因水稻的光合放氧速率，后者达到玉米的82％，显现出类似C4的光合特点，表明ATP是构建C4水稻的关键因子。光氧化条件下，转PEPC+PPDK+ME基因水稻的耐光氧化能力得到进一步的增强。对不同转C4光合酶基因水稻的生理特性研究，发现转PEPC基因水稻显著地增加光合能力。本文进一步研究转PEPC基因水稻的光合保护能力，看到玉米PEPC基因导入水稻后，在高光强下光合速率提高50％，光合作用的光抑制减轻。用PEPC的专一抑制剂证明光合的增加确实是与PEPC基因的导入有关。不同基因型水稻在高光高温自然条件下中午均有光抑制现象，其中转PEPC基因水稻中午Fv／Fm降低较少，光抑制较轻，光能转化为化学能的效率较高，热耗散较低。继续将转PEPC基因水稻经过世代繁殖，逐代检测、选择，得到第8代稳定的种质。通过测定运用稳定和放射性碳同位素、光合速率和荧光特性，结果表明该种质为C3植物，但C4原初光合产物增多，表现出C4光合特性有所改善；转PEPC基因水稻是具高光效、耐光氧化并且其优良的光合特性能稳定遗传的种质，为我国的高光效育种提供了一个新的种质资源。以转PEPC基因水稻种质为父本，与粳稻9516杂交得到F1代，再进行花粉培养，经过光合及酶活性筛选后，再经过4年的定向筛选和监测，得到稳定的花粉株系JAAS45。通过对JAAS45与亲本不同生育期的光合色素含量、净光合速率和水分利用效率的研究，发现JAAS45随着发育阶段的推进，到分蘖期以后，JAAS45的单位叶面积Ch1和Car含量超过9516，并一直维持着较高水平，与PC相近。JAAS45苗期的净光合速率（Pn）与9516相近，而到了分蘖期，其Pn超过了9516，尤其到了抽穗及灌浆期其Pn还超过了PC。从苗期到抽穗期，JAAS45的水分利用效率（WUE）明显高于9516，与PC相接近。说明JAAS45已与父本PC接近，不仅有较高的Pn和较强的抗光抑制能力，而且还能充分利用早晨和傍晚较弱的光强进行光合作用。此外，JAAS45在生长发育期具有较高的WUE，有利于节约农业用水。另外，JAAS45抗光氧化研究发现，光氧化处理后，与其母本9516相比，JAAS45的Fv／Fm、FPSⅡ和qP下降的较少，而qN增加的较多，说明在光氧化条件下，JAAS45吸收的光能中有较多的光能转化为化学能，过剩的光能通过热耗散而减轻光破坏；同时JAAS45的内源活性氧清除酶系超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）诱导的活性高于母本9516，从而有效清除水稻叶片内的活性氧O2T，使活性氧积累较少，因而膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）产生较少，表明JAAS45耐光氧化能力较强。在光氧化条件下，JAAS45的叶绿素和蛋白质含量比9516下降较少，与父本相接近，表现出耐光氧化特性。对JAAS45及父母本进行PCR检测和PEPC酶活性的测定，并测定叶片CO2交换和荧光指标，显示父本的PEPC基因能稳定传递和遗传到杂交后代JAAS45中，且JAAS45具PEPC高表达的特性，在光合特性上表现有较多的饱和光合速率、量子效率、Fv／Fm、qP和非光化学淬灭（qN），具耐光抑制和光氧化的特性。用饲喂C4光合原初产物OAA、MA和PEP，证明它具有有限的C4光合微循环。该研究阐明了转PEPC基因水稻的生理遗传特点，为常规育种和生物技术的结合育种途径提供了依据。

全文目录


目录  4-11
图表目录  11-13
缩略语  13-16
中文摘要  16-19
英文摘要  19-24
第一部 分转C_4光合酶基因水稻的光合生理特性  24-47
  第一章 转C_4光合酶基因水稻及原种的CO_2交换和荧光特性  24-36
    摘要  24
    引言  24-25
    1 材料与方法  25-27
      1.1 植物材料  25
      1.2 C_4酶活性测定  25-27
        1.2.1 PEPC酶活性测定  26
        1.2.2 PPDK酶活性测定  26
        1.2.3 ME酶活性测定  26
        1.2.4 MDH酶活性测定  26-27
      1.3 叶片光—光合曲线测定  27
      1.4 叶片叶绿素荧光参数的测定  27
        1.4.1 光抑制/光氧化处理  27
        1.4.2 荧光动力学参数的测定  27
    2 结果与分析  27-32
      2.1 转C_4光合酶基因水稻叶片内的光合酶活性  27-28
      2.2 转C_4光合酶基因水稻叶片光合作用的光响应  28-30
      2.3 转C_4光合酶基因水稻叶片叶绿素荧光参数的变化  30-32
        2.3.1 转C_4光合酶基因水稻的光抑制表现  30-31
        2.3.2 转C_4光合酶基因水稻的光氧化表现  31-32
    3 讨论  32-33
    参考文献  33-36
  第二章 构建类似C_4水稻的关键因子  36-47
    摘要  36
    引言  36-37
    1 材料与方法  37-40
      1.1 植物材料  37
      1.2 实验方法  37-40
        1.2.1 C_4酶活性测定  37-38
          1.2.1.1 PEPC酶活性测定  37
          1.2.1.2 PPDK酶活性测定  37-38
          1.2.1.3 ME酶活性测定  38
          1.2.1.4 MDH酶活性测定  38
        1.2.2 光合速率测定  38
        1.2.3 活性氧代谢指标的测定  38-40
          1.2.3.1 超氧歧化酶(SOD)活性测定  39
          1.2.3.2 过氧化物酶(POD)活性测定  39
          1.2.3.3 O_2(?)产生速率测定  39-40
          1.2.3.4 丙二醛(MDA)的含量测定  40
          1.2.3.5 蛋白质的含量测定  40
    2 结果与分析  40-43
      2.1 转C_4光合酶基因水稻叶片内的光合酶活性  40
      2.2 转C_4基因水稻在高光强下的光合速率  40-41
      2.3 ATP处理对不同转C_4基因水稻叶切片光合放氧速率的影响  41-42
      2.4 不同转C_4基因水稻的光氧化特性  42-43
    3 讨论  43-44
    参考文献  44-47
第二部分 转PEPC基因水稻的光合生理特性  47-72
  第三章 转PEPC基因水稻的光合能力及光保护效应  47-60
    摘要  47
    引言  47-48
    1 材料与方法  48-51
      1.1 植物材料  48
      1.2 测定地点一天中光强和温度的日变化  48-49
      1.3 光合放氧测定及DCDP的应用  49
        1.3.1 叶片光合放氧速率的测定  49
        1.3.2 抑制剂DCDP的应用  49
      1.4 叶绿素荧光参数的测定  49
      1.5 活性氧代谢指标的测定  49-51
        1.5.1 蛋白质含量测定  49-50
        1.5.2 超氧歧化酶(SOD)活性测定  50
        1.5.3 过氧化物酶(POD)活性测定  50
        1.5.4 O_2~T产生速率测定  50
        1.5.5 丙二醛(MDA)的含量测定  50-51
      1.6 505nm处吸光值日变化的测定  51
    2 结果与分析  51-55
      2.1 自然条件和光抑制条件下DCDP对不同基因型水稻光合速率的影响  51-52
      2.2 不同基因型水稻叶绿素荧光参数的日变化  52-54
      2.3 转PEPC基因水稻活性氧清除相关的酶活性的日变化  54-55
    3 讨论  55-56
    参考文献  56-60
  第四章 转PEPC基因水稻种质的稳定光合生理特性  60-72
    摘要  60
    引言  60
    1 材料与方法  60-64
      1.1 植物材料  60-61
      1.2 PEPC酶活性测定  61
      1.3 光抑制/光氧化处理  61
      1.4 生理特性测定方法  61-64
        1.4.1 叶片光合速率的测定  61
        1.4.2 叶绿素荧光参数的测定  61-62
        1.4.3 活性氧代谢关键酶的测定  62-63
          1.4.3.1 超氧歧化酶(SOD)活性测定  62
          1.4.3.2 过氧化物酶(POD)活性测定  62
          1.4.3.3 蛋白质含量测定  62-63
        1.4.4 有关活性氧化代谢指标的测定  63
          1.4.4.1 O_2~T产生速率测定  63
          1.4.4.2 丙二醛(MDA)的含量测定  63
        1.4.5 ~(14)CO_2的固定和中间代谢产物的检测  63-64
        1.4.6 稳定碳同位素比的测定  64
    2 结果与分析  64-68
      2.1 转PEPC基因水稻是C_3植物,还是C_4植物?  64-65
      2.2 转PEPC基因水稻光合特性的表现  65-66
      2.3 转PEPC基因水稻的光抑制表现  66-67
      2.4 转PEPC基因水稻的光氧化表现  67-68
    3 讨论  68-69
    参考文献  69-72
第三部分 转PEPC基因水稻花粉株系的光合生理特性  72-111
  第五章 转PEPC基因水稻花粉株系不同生育期的光合色素含量,净光合速率,水分利用效率  72-82
    摘要  72
    引言  72-73
    1 材料与方法  73-74
      1.1 植物材料  73-74
        1.1.1 转PEPC基因水稻的定向选育  73
        1.1.2 JAAS45花粉株系的获得  73-74
      1.2 实验方法  74
        1.2.1 叶绿素含量的测定  74
        1.2.2 叶片表观光合速率的测定  74
    2 结果与分析  74-78
      2.1 JAAS45与父母本不同生育期叶片单位叶面积色素含量的比较  74-76
      2.2 JAAS45与父母本不同生育期净光合速率的日变化  76-77
      2.3 JAAS45与父母本不同生育期水分利用效率的日变化  77-78
    3 讨论  78-79
    参考文献  79-82
  第六章 转PEPC基因水稻花粉株系的抗光氧化特性  82-95
    摘要  82
    引言  82-83
    1 材料与方法  83-86
      1.1 植物材料  83-84
        1.1.1 转PEPC基因水稻的定向选育  83
        1.1.2 JAAS45花粉株系的获得  83-84
      1.2 光氧化处理  84
      1.3 叶绿素含量测定  84
      1.4 酶活性测定  84-85
        1.4.1 过氧化物酶(POD)活性测定  84-85
        1.4.2 超氧歧化酶(SOD)活性测定  85
        1.4.3 蛋白质含量测定  85
      1.5 有关活性氧指标的测定  85-86
        1.5.1 O_2~T产生速率测定  85
        1.5.2 丙二醛(MDA)的含量测定  85-86
      1.6 叶绿素荧光动力学参数的测定  86
    2 结果与分析  86-90
      2.1 光氧化处理过程中叶片叶绿素含量和蛋白质含量的变化  86-87
      2.2 光氧化处理过程中叶片叶绿素荧光参数的变化  87-88
      2.3 光氧化处理过程中叶片活性氧的积累  88-89
      2.4 光氧化处理过程中叶片活性氧清除酶活性的变化  89-90
    3 讨论  90-91
    参考文献  91-95
  第七章 转PEPC基因水稻花粉株系的光合生理遗传特点  95-111
    摘要  95
    引言  95-96
    1 材料与方法  96-99
      1.1 植物材料  96
        1.1.1 转PEPC基因水稻的定向选育  96
        1.1.2 JAAS45花粉株系的获得  96
      1.2 转育植株目的基因的检测  96-97
      1.3 PEPC活性的测定  97
      1.4 叶片CO_2气体交换速率测定  97-98
        1.4.1 自然条件下叶片光合速率的测定  97
        1.4.2 光合速率对光强的响应  97
        1.4.3 四碳酸处理的叶片光合速率测定  97-98
      1.5 叶片叶绿素荧光参数的测定  98
        1.5.1 光抑制/氧化处理  98
        1.5.2 四碳酸处理的叶片叶绿素荧光测定  98
        1.5.3 叶片叶绿素荧光参数的测定  98
      1.6 稳定碳同位素比的测定  98-99
    2 结果与分析  99-106
      2.1 分子标记检测  99
      2.2 JAAS45、9516和PC的PEPC活性  99-100
      2.3 JAAS45、PC和9516的光-光合曲线的比较  100
      2.4 在自然条件下,JAAS45、9516和PC的饱和光合速率变化  100-101
      2.5 JAAS45、PC和9516的光抑制和光氧化特性  101-103
      2.6 JAAS45、PC和9516的C_4光合微循环  103-105
        2.6.1 OAA、MA和PEP分别对叶片CO_2气体交换的影响  103-104
        2.6.2 OAA、MA、PEP分别对叶片叶绿素荧光参数的影响  104-105
      2.7 花粉株系JAAS45仍是C_3植物  105-106
    3 讨论  106-107
    参考文献  107-111
第四部分 文献综述——运用C_4光合机理,提高C_3植物的光合速率  111-141
  1 光合作用的C_3途径和C_4途径  111-113
  2 C_4光合途径在C_3植物中的表达  113-121
    2.1 C_3植物中C_4途径代谢酶特性研究  114-116
    2.2 C_4途径的酶分子生物学的研究进展  116-118
    2.3 影响C_4途径在C_3植物中的表达的因素  118-119
      2.3.1 环境因子的影响  118
      2.3.2 植物不同发育阶段的影响  118-119
    2.4 C_4途径在C_3植物中作用机理的探讨  119-121
      2.4.1 碳酸酐酶(CA)作用机理  119
      2.4.2 叶绿体是CO_2的浓缩部位  119-120
      2.4.3 C_4循环途径  120-121
  3 利用转基因技术提高C_3植物光合效率的可行性  121-122
  4 C_4途经基因转C_3植物的基因工程研究  122-132
    4.1 C_4植物中位于叶肉细胞的C_4酶  123-128
      4.1.1 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)  123-126
        4.1.1.1 PEPC转基因的研究进展  123-125
        4.1.1.2 PEPC转基因的生理效应  125-126
      4.1.2 丙酮酸双激酶基因(PPDK)  126-128
        4.1.2.1 PPDK转基因的研究进展  126-127
        4.1.2.2 PPDK转基因的生理效应  127-128
    4.2 位于C_4植物鞘细胞的酶  128-129
      4.2.1 NADP—ME  128-129
      4.2.2 PEP—羧激酶(PEP—CK)  129
    4.3 位于C_4植物鞘细胞的酶  129-132
      4.3.1 NADP—ME  129-130
      4.3.2 PEP—羧激酶(PEP—CK)  130-132
    4.4 多基因的共表达  132
  参考文献  132-141
致谢  141-142
2004年9月—2007年4月在读期间发表论文和获奖情况  142-143

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻
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