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应用基因沉默技术调节大豆脂肪酸代谢进而选育高油和高油酸大豆新材料

作　者: 陈伟
导　师: 刘立侠
学　校: 东北师范大学
专　业: 植物学
关键词: ihpRNA 基因沉默 fad2 pepc 大豆嫁接荧光定量油酸油脂含量
分类号: S565.1
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

应用基因工程技术调节大豆脂类代谢途径,探索相关基因的调控机制,对于大豆脂肪酸合成的基础研究和品质育种是一项有效和快捷的途径。本论文以吉林大豆为材料,以蛋白质和脂肪酸代谢的“底物竞争”假说为依据,采用基因工程技术,探讨大豆fad2(脂肪酸脱氢酶)基因和pepc(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)基因在调控大豆种子脂肪酸合成代谢中的作用,进而选育高油酸和高油的转基因大豆材料。根据基因沉默原理,克隆了大豆fad2和pepc基因的片段,分别构建了基因沉默ihpRNA高效表达载体pBIGFP-FAD2、pBI-FAD2和pBI-PEP;以农杆菌介导的遗传转化方法并结合嫁接技术转化和筛选大豆吉林35,对再生植株进行分子鉴定,基因功能检测和一系列生理生化实验,分析和研究了pepc基因和acc基因在大豆种子发育过程中的时间表达模式。通过农杆菌介导的遗传转化方法将pBIGFP-FAD2载体转化三个高油大豆品种吉林35,吉林47和吉科豆1号。检测报告基因GFP的表达,结果表明,吉林35是大豆胚尖再生系统中最敏感的品种,其表达效率可达到42.9%。本实验优化了大豆胚尖转化系统的卡那霉素筛选压力,并首次尝试将嫁接技术应用到大豆再生系统中替代生根炼苗过程,再生苗的成活率从10%提高到80%,炼苗周期由45天缩短到10天。pBI-FAD2转化吉林35共获得180株再生植株,其中34株PCR阳性植株经分子检测证明外源基因已经整合到植物基因组中,8份材料种子油酸含量有不同程度的提高。阳性材料通过Southern和Northern杂交检测、脂肪酸含量及油酸脱氢比例(ODP)分析,证明ihpRNA沉默fad2基因,导致了油酸含量增加、亚油酸含量降低的效果,并且具有孟德尔单因素遗传规律。阳性植株种子脂肪酸检测表明,油酸含量从对照的17.5%提高到50%左右。通过农杆菌介导转化pBI-PEP载体到吉林35大豆中,共获得再生植株265株,PCR阳性植株64株,Southern杂交证明目的基因整合至基因组中。75%阳性植株(48株)的油含量有不同程度的提高,其中9份阳性材料T1-T4代大豆油含量平均为22.55%,比对照(20.75%)提高了1.8%个百分点;蛋白质含量平均为34.07%,比对照(36.77%)下降2.7%。选取其中4份材料,检测阳性材料(T3代种子)的脂肪酸组分表明,高油材料与对照差异很小。在种子的五个不同发育期检测这4份材料的PEPC酶活性,结果表明其PEPC酶活均较对照低。使用Real-timePCR检测4份种子不同发育期pepc基因和acc基因的表达,结果表明不同发育期阳性种子pepc基因的表达量均比对照低,是同时期对照表达量的0.9倍、0.78倍、0.56倍、0.15倍和0.03倍。在种子不同发育期,阳性材料acc基因的表达量均比同时期对照高,分别是同时期对照表达量的1.23倍、1.56倍、3.01倍、1.72倍和18.78倍。转化阳性材料通过Southern杂交、pepc基因和acc基因的荧光定量表达、脂肪含量、蛋白质含量及酶活的分析,证明ihpRNA沉默pepc基因达到了油脂含量提高,蛋白质含量下降的效果,为验证植物脂肪酸代谢的“底物竞争”假说提供了新的证据。总之,本研究将含有fad2基因和pepc基因的沉默表达载体分别转化大豆,在转基因材料中获得了较好的fad2基因和pepc基因的沉默效果,并筛选出高油酸和高油大豆材料。为深入研究基因工程调控大豆油脂代谢和培育高油、高油酸大豆等方面提供了一定的基础和依据。同时在大豆遗传转化中利用嫁接技术,是提高胚尖转化系统再生频率的有效手段,为大豆再生系统的优化提供了新方法。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
第一章绪论  10-42
  1.1 引言  10-14
    1.1.1 研究背景  11-13
    1.1.2 研究目的和意义  13-14
  1.2 国内外研究概况及分析  14-40
    1.2.1 大豆研究现状  14-19
    1.2.2 植物脂肪酸及脂类基因调控研究进展  19-32
    1.2.3 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)研究概况  32-37
    1.2.4 基因沉默在植物中的研究进展  37-40
  1.3 研究目标和主要研究内容  40-42
    1.3.1 研究目标  40
    1.3.2 研究内容  40-41
    1.3.3 技术路线  41-42
第二章大豆fad2和pepc基因片段的克隆及沉默表达载体的构建  42-60
  2.1 引言  42
  2.2 实验材料  42-44
    2.2.1 植物材料  42-43
    2.2.2 载体和菌株  43
    2.2.3 试剂盒、酶类、生化试剂及PCR 引物  43
    2.2.4 培养基和缓冲液  43
    2.2.5 实验仪器  43-44
  2.3 实验方法(技术路线  44-53
    2.3.1 大豆fad2 基因片段的克隆  44-46
    2.3.2 Fad2 反向重复序列(IR)的构建  46
    2.3.3 Fad2 重组表达载体的构建  46-47
    2.3.4 大豆pepc 基因的片段的克隆  47-50
    2.3.5 Pepc 反向重复序列(IR)的构建  50-52
    2.3.6 Pepc 重组表达载体的构建  52-53
  2.4 结果与分析  53-58
    2.4.1 Fad2 基因沉默表达载体的构建  53-56
    2.4.2 Pepc 基因沉默表达载体的构建  56-58
  2.5 讨论  58-60
第三章大豆遗传转化体系的建立  60-70
  3.1 引言  60-61
  3.2 实验材料  61-62
    3.2.1 植物材料  61
    3.2.2 质粒和菌种  61
    3.2.3 试剂盒、酶类、生化试剂和培养基  61-62
    3.2.4 实验仪器设备  62
  3.3 实验方法（技术路线）  62-65
    3.3.1 农杆菌感受态制备及转化  62-63
    3.3.2 大豆的胚尖再生系统的优化  63-64
    3.3.3 胚尖再生苗的嫁接  64-65
  3.4 实验结果  65-68
    3.4.1 转基因大豆基因型筛选  65-66
    3.4.2 筛选剂浓度的确定  66-67
    3.4.3 胚尖转化和嫁接  67-68
  3.5 讨论  68-70
第四章转基因大豆的分子生化分析和基因表达模式分析  70-95
  4.1 引言  70
  4.2 实验材料  70-73
    4.2.1 植物材料  70
    4.2.2 质粒  70-71
    4.2.3 试剂盒、酶类、培养基和生化试剂  71-72
    4.2.4 仪器设备  72-73
  4.3 转化pBI-FAD2 大豆的检测方法  73-76
    4.3.1 转化植株的PCR 检测  73-74
    4.3.2 转化植株的Southern Blot 检测  74-75
    4.3.3 转化植株的Northern Blot 检测  75
    4.3.4 转化植株种子脂肪酸含量测定  75-76
  4.4 转化pBI-PEP 大豆的检测方法  76-80
    4.4.1 转化植株分子检测  76
    4.4.2 转化植株生化检测  76-78
    4.4.3 大豆籽粒不同发育期酶活检测和基因表达分析  78-80
  4.5 转化pBI-FAD2 的再生植株检测结果与分析  80-84
    4.5.1 转化植株的NPTII 基因PCR 检测  80-81
    4.5.2 转化植株的Southern 和Northern 检测  81-82
    4.5.3 脂肪酸含量和油酸脱氢比例  82-84
  4.6 转化pBI-PEP 的再生植株的检测结果与分析  84-92
    4.6.1 转化植株分子生物学检测  84-85
    4.6.2 转化植株生化测定  85-89
    4.6.3 不同发育期转化植株酶活和基因表达分析  89-92
  4.7 讨论  92-95
结论  95-96
参考文献  96-112
附录引物序列列表  112-113
在学期间公开发表论文及著作情况  113-114
致谢  114

应用基因沉默技术调节大豆脂肪酸代谢进而选育高油和高油酸大豆新材料

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