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猪14-3-3 THETA基因功能及转录调控的初步研究

作　者: 马志雄
导　师: 熊远著
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 猪 14-3-3 theta 启动子 Trichostatin A 背最长肌表达规律
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

14-3-3基因家族的蛋白是物种间保守的酸性蛋白家族,哺乳动物中该基因家族有7个不同的亚型(β,γ,ε,ζ,η,θ,σ,其中α,δ是β,ζ磷酸化形式,θ,τ为同一亚型),该家族的基因一般以同二聚体或异二聚体的形式发挥生物学功能,它们往往以一种配体的形式和其他的蛋白相互作用,研究表明该基因家族可以和200多种蛋白相互作用,其中大多的互作的蛋白质是磷酸化蛋白。14-3-3 theta基因也被证明可能通过拮抗ASK1信号通路产生抗凋亡的作用,因此他们推测该基因在心肌细胞的抗凋亡过程中起着重要的作用,14-3-3theta基因可能通过影响多个信号通路来维持心肌细胞的存活。虽然对于该家族及该基因的研究比较多,但对该家族的转录调节和该基因在肌肉发育中参与的功能研究的还比较少,而有证据暗示该基因可能对肌肉的生物学功能有着重要的作用,对此本论文对猪的14-3-3 theta进行了如下研究：1、对大白及梅山猪胚胎65d,出生后3d,60d,120d的背最长肌的14-3-3theta基因表达规律进行了分析,结果表明该基因在大白猪中胚胎65d表达量最高,至出生后60d表达量降至最低,但在梅山猪中该基因在出生后60d的表达量达到四个时期的最高水平。组织表达谱分析表明,该基因在猪各种骨骼肌和平滑肌中表达很高,但在在心肌中表达较低。2、通过电子克隆获得14-3-3 theta基因启动子-1469-+345bp(第二个潜在的转录起始位点为+1)长1814bp的区域,并对该启动子区域的序列进行了生物信息学分析,表明该基因存在两处潜在的转录起始位点,在线软件预测该基因的主要基础调控元件位于第一个潜在的转录起始位点附近。利用获得的启动子构建了8个5’缺失片段的报告载体来检测基因的调控区域和调控元件,结果表明第一个潜在转录起始位点附近区域有促进转录的转录元件存在,第二个潜在转录起始位点区域对于转录是必不可少的,缺失该区域后转录活性基本丧失,推测第二个潜在转录起始位点更有可能是真正的转录起始位点。用去乙酰化酶抑制剂TSA处理转染缺失片段载体的细胞,发现该启动子活性受到抑制,并且随着TSA处理浓度的升高,对启动子及活性的抑制作用增强,TSA的这种抑制作用的机制可能是TSA参与对转录元件结合的相关转录因子乙酰化修饰的调控。3、TSA处理PK-15细胞系及猪的肌卫星细胞均发现,该基因的表达能受到TSA的促进,而且这种促进作用在TSA处理后的1h.内达到最高值,与处理转染缺失载体后的双荧光素酶报告系统的活性结果并不一致。4、利用C2C12细胞作为模型,分析了C2C12细胞中14-3-3theta基因在分化过程中的表达规律,发现该基因在分化过程中急剧的降低,但TSA处理组与对照组的14-3-3 theta基因的表达模式一致。5、扩增获得675bp的编码区,编码224个氨基酸,插入到prk-flag载体中,成功构建了该蛋白与FLAG-标签蛋白融合表达的载体,并用western blotting检测到了融合蛋白的表达。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
1 文献综述  12-23
  1.1 表观修饰和肌肉细胞的发生发展及肌纤维类型的关系  12-13
  1.2 肌肉生成中组蛋白去乙酰化酶和组蛋白乙酰化酶参与的功能  13-15
    1.2.1 组蛋白去乙酰化酶家族  13-14
    1.2.2 组蛋白去乙酰化酶家族功能  14-15
  1.3 14-3-3基因家族基因的研究进展  15-18
    1.3.1 14-3-3基因家族基因发挥生物学功能的作用方式  15-16
    1.3.2 14-3-3蛋白家族参与的信号通路  16
    1.3.3 14-3-3theta蛋白的研究进展  16-18
  1.4 Trichostatin A及其组蛋白去乙酰化酶抑制活性的调控功能  18-21
    1.4.1 Trichostatin A简介  18
    1.4.2 Trichostatin A对基因的调控研究  18-21
  2 本研究的目的和意义  21-23
3 试验材料  23-27
  3.1 试验样品  23
    3.1.1 DNA样品  23
    3.1.2 组织样品  23
  3.2 主要仪器和设备  23
  3.3 实验用耗材  23-24
  3.4 载体,菌株及细胞系  24
  3.5 缓冲液和常用试剂的配制  24-25
  3.6 主要药品及试剂  25-27
4 试验方法  27-38
  4.1 猪组织总RNA的提取及cDNA的制备  27-28
    4.1.1 组织总RNA的提取  27
    4.1.2 细胞总RNA的提取  27-28
    4.1.3 RNA的琼脂糖凝胶电泳检测  28
    4.1.4 反转录反应(Reverse transcription PCR)  28
  4.2 猪14-3-3 theta基因编码区及启动子的克隆、测序  28-29
    4.2.1 引物设计  28-29
    4.4.2 PCR反应  29
  4.3 产物的回收、纯化和克隆测序  29-30
    4.3.1 PCR产物的回收与纯化  29-30
    4.3.2 载体连接(参照pMD-18T Vector System说明书)  30
    4.3.3 连接产物的转化  30
    4.3.4 阳性克隆子的鉴定及测序  30
  4.4 DNA序列的生物信息学分析及相应的软件  30-31
  4.5 猪14-3-3 theta基因转录水平组织表达谱分析  31-32
    4.5.1 总RNA的提取及RNA浓度与质量的检测  31
    4.5.2 Q-PCR扩增体系  31-32
  4.6 融合表达载体及启动子活性鉴定载体的构建  32-33
    4.6.1 目的片段的获得  32
    4.6.2 目的片段与载体的连接  32
    4.6.3 重组质粒的转化和鉴定  32
    4.6.4 重组质粒的提取  32-33
  4.7 细胞培养和瞬时转染  33-34
    4.7.1 细胞培养与传代  33
    4.7.2 细胞瞬时转染  33-34
  4.8 双荧光素酶活性测定  34
    4.8.1 细胞转染  34
    4.8.2 细胞裂解及活性测定  34
  4.9 SDS-PAGE胶的制作,蛋白质电泳及凝胶的染色  34-36
    4.9.1 SDS-PAGE胶的制作  34-35
    4.9.2 蛋白质的电泳  35-36
    4.9.3 胶体考马斯亮蓝染色  36
  4.10 细胞中蛋白质的提取,蛋白质量的检测及蛋白浓度的测定  36-37
    4.10.1 细胞中蛋白质的提取  36
    4.10.2 蛋白质量的检测  36
    4.10.3 蛋白浓度的测定  36-37
  4.11 Western Blotting对目的蛋白的检测  37-38
5 实验结果  38-51
  5.1 总RNA的提取  38
  5.2 猪14-3-3 theta基因的编码区序列克隆、测序  38-39
  5.3 细胞蛋白质量的检测  39-40
  5.4 蛋白浓度的测定  40
  5.5 融合蛋白的检测  40-41
  5.6 14-3-3 theta基因在大白猪的组织表达分析  41-42
  5.7 14-3-3 theta基因在大白猪及梅山猪背最长肌中的表达分析  42-43
  5.8 14-3-3 theta基因在C2C12细胞分化过程中的表达趋势及TSA对分化的影响  43-46
  5.9 启动子的获得  46-47
  5.10 缺失载体的构建  47-48
  5.11 启动子活性的分析  48-50
  5.12 TSA处理对猪PK-15及猪肌卫星中14-3-3 theta表达的影响  50-51
6 讨论  51-54
  6.1 14-3-3 theta基因的转录调节和TSA对该基因的复杂调节机制的推断  51-52
    6.1.1 启动子活性的分析  51
    6.1.2 TSA对该基因的复杂调节机制的推断  51-52
  6.2 C2C12细胞的分化研究及该基因表达模式  52-53
  6.3 14-3-3 theta基因在大白猪及梅山猪背最长肌中差异表达研究  53-54
下一步工作  54-55
小结  55-56
参考文献  56-62
致谢  62

猪14-3-3 THETA基因功能及转录调控的初步研究

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