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嗜肺军团菌LAMP检测方法的建立

作　者: 吕沁风
导　师: 沈建根
学　校: 浙江大学
专　业: 免疫学
关键词: 嗜肺军团菌环介导等温扩增技术(LAMP) mip基因检测
分类号: R115
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 133次
引　用: 1次
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内容摘要

[背景和目的]嗜肺军团菌是一种环境感染性致病菌,可引起严重的急性呼吸道传染病,是非典型肺炎的重要病原体之一。该菌首先发现于1976年的美国一次军人聚会,故称作军团菌。嗜肺军团菌由气溶胶介导传播,可引起暴发流行或散发病例。军团菌肺炎不会自然康复,如不进行及时治疗,1-7天即可能死亡,流行致死率高达30%,散发致死率甚至高达80%。随着社会经济的发展,生活水平的不断提高,城市建筑物越来越多地采用了集中空调通风系统,它在给人们带来舒适的同时,由于空调通风系统本身设计、安装、运行管理、清洁等各环节存在的不合理,可能产生和加重空气污染,造成空气质量下降,尤其是受到病原微生物污染而可能引发呼吸道传染,已成为建筑物室内空气污染的主要来源之一。因此,军团菌病在公共卫生上意义重大,倍受各方面的关注。嗜肺军团菌分离培养法和血清学检测敏感性低,据相关报道仅为25%-75%,需要较长的培养时间,导致军团菌病较低的诊断率和较高的死亡率。现有的分子生物学检测方法需要昂贵及精密的仪器设备和专业的技术人员,不能适应基层实验室及疫情现场的检测需求。本文旨在探索建立一种快速简便而且成本较低的嗜肺军团菌分子检测方法,适用于基层实验室或检疫口岸的快速检测。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是近几年来发展的一种新的核酸扩增方法,该法在保持PCR技术优点的基础上,进一步增强了反应的特异性和缩短了检测时间；特别是它不需使用热循环仪,在等温条件下就能完成反应,且扩增产物用肉眼能观察,更便于推广应用。[实验方法]运用LAMP设计一套引物特异性识别嗜肺军团菌毒力基因-mip基因的多个特殊区域,在等温条件下,特异性地快速扩增目的基因片段,并产生白色焦磷酸盐沉淀,加入荧光染料后,可出现强荧光。针对18株嗜肺军团菌和5株其他细菌进行检测,并与普通PCR方法进行比对,验证该方法的特异性和灵敏度。[结果]嗜肺军团菌LAMP检测在1小时左右即可完成,所有嗜肺军团菌均产生肉眼可见的白色沉淀,对照组其他不同菌株均不能产生沉淀；加入荧光染料smart green后,嗜肺军团菌菌株均产生强绿色荧光,其他菌株呈弱荧光信号。实验表明该方法的灵敏度高于普通PCR,基因组DNA和水样中该方法的检出限分别为576龟和8cfu/ml。[结论] LAMP可在简易的实验环境下快速、特异、灵敏地检测嗜肺军团菌。

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致谢  4-5
序言  5-6
中文摘要  6-8
Abstract  8-11
目次  11-12
引言  12-14
第一部分嗜肺军团菌普通PCR扩增  14-19
  1.材料和方法  14-17
  2.结果  17-19
第二部分嗜肺军团菌LAMP扩增  19-26
  1.材料和方法  19-22
  2.结果  22-26
讨论  26-28
结论  28-29
参考文献  29-32
综述  32-43
作者简历及在读期间所取得的科研成果  43-44

嗜肺军团菌LAMP检测方法的建立

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