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肺癌细胞株APC基因甲基化与表达的研究及模拟肺癌患者血浆中APC基因甲基化的检测

作　者: 张丽霞
导　师: 潘世扬
学　校: 南京医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 肺癌细胞株 APC 甲基化 5-杂氮-2’-脱氧胞嘧啶 MSP 基因芯片 实时荧光定量PCR Western blot 血浆DNA
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


背景：近年来表观遗传学(epigenetic)的概念越来越受到关注，表观遗传学主要指基于非基因序列改变所致基因表达水平的变化，包括染色质构象变化、DNA甲基化及非编码RNA的调控。有关表观遗传学改变是否和遗传学改变一样在肿瘤的发生发展中发挥作用已经争论了很多年，近些年的研究证实在肿瘤的发生发展中二者不仅都有作用，而且二者在促进肿瘤的发生发展中还有内在的联系。肿瘤细胞的甲基化模式发生改变，呈基因组全面的低甲基化和抑癌基因的高甲基化，并认为这种异常甲基化模式改变是肿瘤发生的重要特征。传统观点认为，抑癌基因失活有两条途径：突变和缺失。现在越来越多的研究表明甲基化是抑癌基因失活的另一重要机制。现已证实，许多抑癌基因的低表达或失活，直接由基因启动子甲基化所致，与突变和缺失无关。抑癌基因的甲基化在肿瘤发展过程中的作用越来越被人们所认识，并成为肿瘤诊断中的一个新兴的分子标志。近年来，世界各国肺癌的发病率和病死率均呈上升趋势，死于肿瘤的男性病人中肺癌已居首位。肺癌因为早期诊断困难，往往发现已经是中晚期，给其治疗带来很大困难，死亡率很高，因此寻找新的用于肺癌早期诊断的分子标志具有重要的临床意义。目的：研究APC基因甲基化与其表达的关系和体外去甲基化干预对APC基因表达的影响；研究模拟肺癌患者血浆DNA中APC基因甲基化的最低检测限，确定不同甲基化检测技术在早期肺癌诊断中的应用价值。方法：提取3株肺癌细胞(小细胞肺癌细胞株NCI-H446、肺腺癌细胞株SPCA1、大细胞肺癌细胞株NCI-H460)的DNA，分别以经转甲基处理和未处理的脐带血(cord blood，CB)DNA为阳性、阴性对照，亚硫酸氢盐化学修饰后，用甲基化特异性基因扩增(methylation specificpolymerase chain reaction，MSP)、甲基化基因芯片和克隆测序的方法对APC基因启动子1A区CpG岛甲基化状态进行研究；并用以SYBRGreenⅠ为荧光染料的实时荧光定量PCR(real time polymerase chainreaction)和Western blot技术，检测APC基因的表达；对甲基化阳性的NCI-H460细胞，分别用不同浓度的5-杂氮-2′-脱氧胞嘧啶(5-aza-2-deoxycytidine，5-aza-dC)试剂进行脱甲基化反应，用荧光定量PCR及Western blot技术检测其表达变化。以酚／氯仿方法提取NCI-H460细胞DNA，紫外分光光度计定量并以10倍稀释的浓度梯度依次投入相同的200μl健康人血浆中，从而模拟肺癌患者血浆，利用磁珠核酸提取方法从模拟肺癌患者血浆样本中提取血浆DNA，对血浆DNA模板进行亚硫酸氢盐化学修饰，分别以普通MSP、SYBR GreenⅠ荧光染料和TaqMan荧光探针的荧光定量MSP方法研究血浆中APC基因甲基化最低检测限。结果：细胞株NCI-H446和SPCA1的APC基因启动子甲基化为阴性，而NCI-H460细胞为阳性，且为等位基因杂合型甲基化；NCI-H460细胞的APCmRNA转录较NCI-H446和SPCA1有明显的下降，分别只有前两者的26.04％和32.36％，经5-aza-dC脱甲基化作用后，NCI-H460细胞的APC转录水平增加了约5～10倍；NCI-H446、SPCA1及225 nmol 5-aza-dC脱甲基化作用后NCI-H460细胞的蛋白表达分别是NCI-H460细胞的12.9、7.1、3.52倍。利用荧光探针、荧光染料的荧光定量MSP以及普通MSP检测模拟肺癌患者血浆APC基因甲基化的最低检测限分别为每ml血液中30、300、3000个肿瘤细胞的基因组DNA。因此，利用荧光探针的荧光定量MSP分别比利用荧光染料的荧光定量MSP和普通MSP检测技术敏感性高出10倍和100倍。结论：APC基因启动子区存在的某些区域高甲基化对APC基因转录和蛋白表达有显著抑制作用，且在体外可以被脱甲基化试剂5-aza-dC逆转。实时荧光定量MSP检测技术具有高灵敏度，该技术用于肺癌患者血浆APC基因甲基化检测，可能有助于肺癌早期诊断。

全文目录


论文摘要(中文)  4-7
论文摘要(英文)  7-11
英文缩略词表  11-12
前言  12-16
实验仪器与试剂  16-20
  1 实验仪器  16-17
  2 试剂  17-20
第一部分 三株肺癌细胞APC基因启动子区甲基化状态的检测  20-37
  一 实验方法  21-29
    1 标本收集  21
    2 细胞培养  21
    3 细胞克隆培养  21
    4 脐带血单个核细胞分离  21-22
    5 酚/氯仿抽提法提取DNA  22
    6 DNA浓度和纯度的检测  22-23
    7 甲基化阳性和阴性标准品的制备  23
    8 DNA的亚硫酸氢盐化学修饰  23-24
    9 MSP  24-25
    10 BSP  25
    11 TA克隆测序  25-27
    12 基因芯片  27-29
  二 实验结果  29-33
    1 MSP  29
    2 TA克隆测序  29-32
    3 基因芯片  32-33
  三 分析讨论  33-37
第二部分 三株肺癌细胞株APC基因表达的研究  37-48
  一 实验方法  37-42
    1 细胞培养  37
    2 脱甲基化处理NCI-H460细胞  37-38
    3 样本制备  38-39
    4 荧光定量RT-PCR  39-40
    5 Western blot蛋白印迹术分析  40-42
  二 实验结果  42-45
    1 荧光定量RT-PCR  42-43
    2 Western blot  43-45
  三 分析讨论  45-48
第三部分 模拟肺癌患者血浆中APC基因甲基化最低检测限的研究  48-57
  一 实验方法  49-51
    1 样本收集  49
    2 肿瘤病人血浆的模拟  49
    3 磁珠法提取DNA  49-50
    4 化学修饰  50
    5 MSP与SYBR Green Ⅰ染料实时荧光定量MSP检测  50
    6 TaqMan荧光探针实时荧光定量MSP  50-51
  二 实验结果  51-53
    1 MSP  51
    2 SYBR Green Ⅰ模式荧光定量MSP  51-52
    3 TaqMan荧光探针模式实时荧光定量MSP  52-53
  三 分析讨论  53-57
小结  57-58
参考文献  58-64
致谢  64-65
综述  65-77
发表论文  77-86

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 呼吸系肿瘤 > 肺肿瘤
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