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茯苓种质资源多样性与代料栽培技术初步研究

作　者: 李剑
导　师: 边银丙
学　校: 华中农业大学
专　业: 特种植物育种与栽培
关键词: 茯苓 菌株 酯酶同工酶 ISSR分析 代料栽培
分类号: S567.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


茯苓[Wolfporia cocos(Schw.) Ryv. et Gilbn.]为我国传统常用中药材之一，广泛用于中成药及保健食品生产中，具有较高的经济价值。茯苓人工栽培长期以来一直是采用松木进行段木栽培，所用栽培菌株主要依靠野生菌株驯化而来。为了充分利用我国丰富的茯苓种质资源，减少茯苓栽培对松木资源的消耗，充分利用松木屑和农作物秸秆废料资源，本课题采用酯酶同工酶和ISSR分子标记技术，对我国茯苓栽培菌株及部分野生菌株的遗传多样性进行了分析，并开展了茯苓代料栽培技术的研究。主要研究结果如下：对茯苓27个供试菌株进行酯酶同工酶分析，共检测到了186条酯酶同工酶谱带，每个菌株所具有的酶带数为5～9条不等，多数为6～8条，27个供试菌株共有17种酶谱类型，其中部分菌株之间酶谱完全相同。聚类分析结果表明，在81％的相似水平上，供试的27个菌株可分为七个大类。第一类：Y1(宝山)、云苓1号、5.78、茯苓3号、A9、A10、岳西、T1、901、Z(z)、50864、靖洲28、GD和GZ；第二类：P0、华中、鄂1号和茯苓28；第三类：SD；第四类：50478、神苓1号(S1)、SC、50876和DB；第五类有：闽006号；第六类有：L；第七类：Z(1)。部分菌株之间相似系数为1.0，表明它们亲缘关系很近，这些菌株可能存在同物异名现象。采用来源不同的4个茯苓菌株对40个ISSR引物进行筛选，选择扩增稳定、多态性较好的12个引物用于ISSR分析。在正交优化扩增体系和筛选退火温度的基础上，用12条引物对27个茯苓菌株进行ISSR指纹图谱分析，共扩增出85条DNA带，其中多态性带64条，占总带数的75.29％，平均每个引物扩增出7.1条带。聚类分析表明，在82％的相似水平上，27个茯苓菌株可分为六个大类。第一类：Y1(宝山)、A9、50478、Z(z)、鄂1号、Z(1)、50864、DB、901、5.78、GZ、GD、云苓1号、茯苓3号、岳西、华中、茯苓28、靖洲28、A10、T1；第二类：野生菌株P0和闽006号；第三类：山东SD；第四类：安徽的野生菌株L；第五类：50876和S1；第六类：四川的SC菌株。ISSR分析进一步验证了酯酶同工酶分析的结果，同时也弥补了酯酶同工酶在蛋白质水平上分析的不足。ISSR和酯酶同工酶分析的结果，同时将野生菌株L、山东菌株SD及福建菌株闽006各自划为独立的三个类群中，并且均将GZ和GD，云苓1号和茯苓3号，Z(z)和50864，S1与50876等菌株归为相似系数较高的同类中。但ISSR分析结果与酯酶同工酶分析结果在一定程度上也存在着差异。本研究首次应用ISSR标记技术对茯苓进行菌株鉴定和种质资源多样性分析，表明ISSR标记技术具有简便、高效，多态性高，重复性好的特点，在茯苓菌株鉴别及亲缘关系分析中具有较高的应用价值。茯苓代料栽培技术研究表明，以松木屑、松木碎块作为代料栽培的主要原料，采用栽培地搭置低矮简易棚，试验效果较好，其茯苓引疤接种成活率达92.85％，平均生物学效率达18.25％，与段木栽培对照处理的结果接近，茯苓代料栽培首次试验取得初步成功。棚室栽培和大田露地栽培的效果，较大田低矮简易棚略差；以松木屑、松木碎块为主要栽培原料的配方，栽培效果优于以棉籽壳、松木碎块为主要栽培原料的配方。茯苓代料栽培技术的研究有待进一步的深入。

全文目录


摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
第一章 文献综述  11-25
  1.茯苓概述  11-14
    1.1 茯苓的资源分布  11
    1.2 茯苓栽培历史及产区变迁  11-13
    1.3 茯苓的药用价值  13
    1.4 茯苓的形态特征及生长习性  13-14
  2.茯苓栽培技术  14-16
  3.遗传标记及其在食(药)用真菌中的应用  16-24
    3.1 形态学标记  16
    3.2 细胞学标记  16-17
    3.3 生化标记  17-18
    3.4 分子标记  18-24
      3.4.1 限制性片段长度多态性  19-20
      3.4.2 扩增片段长度多态性  20
      3.4.3 随机扩增多态性DNA  20-21
      3.4.4 特征性片段扩增区域  21-22
      3.4.5 相关序列扩增多态性  22
      3.4.6 简单序列间重复扩增  22-24
  4.研究目的和意义  24-25
第二章 茯苓菌株的酯酶同工酶分析  25-36
  1.引言  25
  2.材料与方法  25-29
    2.1 试验材料  25-27
      2.1.1 供试菌株  25
      2.1.2 供试培养基  25-26
      2.1.3 仪器与设备  26-27
      2.1.4 同工酶分析试剂  27
    2.2.试验方法  27-29
      2.2.1 菌丝体培养  27-28
      2.2.2 样品处理  28
      2.2.3 凝胶制备  28
      2.2.4 点样  28
      2.2.5 电泳  28-29
      2.2.6 取胶染色及酯酶同工酶检测  29
      2.2.7 试验结果的观察和统计分析  29
  3.结果与分析  29-34
    3.1 酯酶同工酶酶谱分析  29-32
    3.2 聚类分析  32-34
  4.讨论  34-36
第三章 茯苓菌株的ISSR分析  36-52
  1.引言  36
  2.材料与方法  36-41
    2.1 试验材料  36-38
      2.1.1 供试菌株  36
      2.1.2 仪器与设备  36
      2.1.3 试验试剂  36-37
      2.1.4 ISSR引物  37-38
    2.2 试验方法  38-41
      2.2.1 基因组DNA提取  38-39
      2.2.2 DNA的检测与测定  39
      2.2.3 ISSR引物筛选  39
      2.2.4 反应体系的正交优化  39-40
      2.2.5 退火温度筛选  40-41
      2.2.6 反应体系稳定性检测  41
      2.2.7 ISSR分析  41
  3.结果与分析  41-48
    3.1 27个茯苓菌株DNA的检测与测定  41-42
    3.2 引物筛选  42
    3.3 反应体系的正交优化  42-43
    3.4 退火温度筛选  43-44
    3.5 反应体系稳定性检测  44-45
    3.6 ISSR分析  45-48
      3.6.1 ISSR指纹图谱分析  45-47
      3.6.2 聚类分析  47-48
  4.讨论  48-52
    4.1 ISSR引物筛选  48-49
    4.2 反应体系的优化及退火温度的筛选  49-50
    4.3 ISSR分析  50
    4.4 ISSR分析与酯酶同工酶分析结果的比较  50-52
第四章 茯苓代料栽培技术的初步研究  52-68
  1.引言  52
  2.材料和方法  52-57
    2.1 试验材料  52-53
      2.1.1 供试菌株  52
      2.1.2 供试培养基  52-53
      2.1.3 分离发酵料中的微生物所用培养基  53
      2.1.4 试验材料  53
      2.1.5 低矮简易棚制作与棚室层架制作  53
    2.2 试验方法  53-57
      2.2.1 麦粒培养基的制作  53-54
      2.2.2 代料栽培培养基的制作  54
      2.2.3 发酵料栽培培养基的制作  54
      2.2.4 室内棚室代料栽培模式  54-55
      2.2.5 室外大田代料栽培模式  55
      2.2.6 对照  55
      2.2.7 小区设计与重复  55-56
      2.2.8 发酵料过程中微生物变化的分析  56-57
      2.2.9 生物学效率的计算  57
  3.结果与分析  57-65
    3.1 菌丝生长速度测定  57-58
    3.2 室外大田代料栽培的产量统计及分析  58-59
    3.3 室内棚室代料栽培产量统计及分析  59-61
    3.4 Duncan新复级差分析  61-62
    3.5 大田和棚室发酵料栽培  62-65
      3.5.1 堆置发酵料过程中的温度变化情况分析  62-63
      3.5.2 堆置发酵过程中微生物变化情况分析  63-64
      3.5.3 发酵料栽培结果  64-65
  4.讨论  65-68
参考文献  68-74
附录一 27个茯苓菌株酯酶同工酶相似系数(S)表  74-76
附录二 部分菌株间的拮抗试验  76-77
附录三 发满茯苓菌丝的菌袋  77
附录四 大田袋栽时接"引疤"的情景  77-78
附录五 大田低矮简易棚栽培条件下产出的茯苓  78
附录六 A3棚室栽培条件下产出的茯苓  78-79
附录七 A4棚室栽培条件下产出的茯苓  79-80
致谢  80

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 药用作物 > 菌类 > 茯苓
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