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TMB-8对小鼠体外免疫应答和迟发型超敏反应的影响

作　者: 叶雪仪
导　师: 曾耀英
学　校: 暨南大学
专　业: 免疫学
关键词: TMB-8 淋巴细胞活化增殖细胞周期钙离子 Fluo-4/AM 细胞因子 CBA 迟发型超敏反应
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

目的：研究胞内钙离子释放阻断剂8-（N，N-二乙胺）辛基-3，4，5-三甲氧基苯甲酸酯（[8-（Diethylamino）Octyl-3，4，5-Trimethoxybenzoate]，TMB-8）对小鼠体外免疫应答和体内迟发型超敏反应的影响，评价TMB-8的免疫抑制效应。方法：1．分别以刀豆蛋白A（Concanavalin A，Con A）和／或2-丁酸佛波醇酯（Phorbol12，13-dibutyrate，PDB）加离子霉素（Ionomycin，Ion）作为刺激原，以流式细胞术为基础技术，分析TMB-8对小鼠体外淋巴细胞行为的影响：利用荧光标记抗体染色技术检测淋巴细胞早期活化标记物CD69的表达百分率；以活体染料二乙酰羧基荧光素-琥珀酰亚胺酯（Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFDA-SE）标记，分析TMB-8对淋巴细胞增殖的影响；以碘化丙啶（Propidium iodide，PI）染色分析细胞周期的分布情况。并以噻唑兰（Monotetrazolium，MTT）比色法测定TMB-8对脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激B淋巴细胞增殖的影响。2．通过收集ConA作用下的淋巴细胞培养上清，以流式微球技术（Cytometric bead array,CBA）检测分析TMB-8对该上清中Th1／Th2型细胞因子（IL-2，IFN-γ，TNF-α，IL-4，IL-5）分泌的影响。3．利用Fluo-4／AM染色，结合流式细胞术检测TMB-8对Con A和／或Ion作用下小鼠淋巴细胞内Ca²⁺浓度的影响。4．建立动物模型，采用二硝基氟苯（Dinitrofluorobenzene，DNFB）腹部致敏、耳廓激发的方法建立小鼠迟发型超敏反应（Delayed type hypersensitivity，DTH）模型。以耳厚差、耳重差及左耳组织切片的病理变化观察TMB-8对小鼠DTH的影响；同时以胸腺指数、脾脏指数，分析TMB-8对DTH小鼠淋巴器官的影响；分离DTH小鼠的脾脏、淋巴结、胸腺分别进行细胞增殖、周期和凋亡的检测，初步评价TMB-8在体内的免疫学效应。结果：1．在所设的浓度下，TMB-8对静息淋巴细胞无明显影响。在Con A刺激下，四个浓度的TMB-8对CD3⁺淋巴细胞的CD69⁺表达均有抑制作用（P＜0.05），且对CD3^-淋巴细胞的CD69⁺表达也有明显的抑制作用（P＜0.01）。对Con A或（PDB+Ion）刺激48h和72h下的淋巴细胞增殖呈明显抑制效应（P＜0.01）。细胞周期分析结果表明TMB-8能抑制细胞进入S期。MTT比色法测定显示TMB-8对B淋巴细胞增殖呈抑制效应。2．TMB-8对Con A活化的淋巴细胞培养上清中Th1型（IL-2，IFN-γ，TNF-α）和Th2型（IL-4，IL-5）细胞因子的分泌均有抑制作用（P＜0.05）。3．TMB-8对ConA或Ion所诱导的细胞内Ca²⁺浓度的升高有抑制作用，且随着时间的延长，这种抑制作用越来越明显。4．TMB-8能够明显抑制DTH小鼠增加的左耳厚度差（P＜0.01）和重量差（P＜0.05），并可减低DTH小鼠的脾脏指数和胸腺指数（P＜0.05）。同时组织切片显示TMB-8可明显抑制左耳组织水肿和炎细胞浸润。结合体外实验结果表明，TMB-8对DTH小鼠淋巴细胞增殖有明显的抑制作用，主要抑制细胞进入S期，并且能抑制DTH小鼠胸腺细胞的凋亡（P＜0.01）。结论：TMB-8在体外能抑制淋巴细胞的早期活化、增殖，并且能抑制淋巴细胞进入细胞分裂周期，说明其具有免疫调节作用。同时研究还证实它能抑制ConA介导的淋巴细胞Th1型和Th2型细胞因子的分泌。TMB-8能下调Con A或Ion诱导的细胞内Ca²⁺浓度的上升，推测这是TMB-8发挥免疫抑制作用的基础。在这些研究结果的基础上，通过建立小鼠DTH动物模型，证实TMB-8在体内能抑制T淋巴细胞介导的皮肤炎症反应。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-8
目录  8-9
前言  9-16
  1. TMB-8的应用回顾与研究现状  9-10
  2. 适应性免疫应答与Ca~(2+)的关系  10-12
  3. 迟发型超敏反应(Delayed type hypersensitivity,DTH)的发病机制  12-13
  4. 课题设计思想与意义  13
  参考文献  13-16
第一部分 TMB-8对多克隆刺激剂作用下小鼠淋巴细胞体外行为的影响  16-32
  材料与方法  16-20
  结果  20-29
  讨论  29-31
  参考文献  31-32
第二部分 TMB-8对淋巴细胞培养上清中的细胞因子的影响  32-42
  材料与方法  32-34
  结果  34-37
  讨论  37-39
  参考文献  39-42
第三部分 TMB-8对淋巴细胞内钙离子浓度变化的影响  42-50
  材料与方法  42-43
  结果  43-48
  讨论  48-49
  参考文献  49-50
第四部分 TMB-8对DNFB诱发的小鼠迟发型超敏反应的影响  50-60
  材料与方法  50-53
  结果  53-56
  讨论  56-58
  参考文献  58-60
结论和建议  60-61
索引  61-62
在学期间发表的论文清单  62-63
后记  63

TMB-8对小鼠体外免疫应答和迟发型超敏反应的影响

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