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敌百虫诱导近江牡蛎（Crassostrea hongkongensis）HSC70基因表达的定量研究

作　者: 李春勇
导　师: 张其中
学　校: 暨南大学
专　业: 水生生物学
关键词: 近江牡蛎 β-actin 18S rRNA GAPDH HSC70 Real-time PCR 基因表达
分类号: X174
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

海洋环境污染日益严重，分子水平的生物标志物，对污染物的反应快速灵敏，能指示分子生物标志物所在生物体所处环境的污染状态及其潜在危害，为严重毒性伤害提供早期预警，可以作为评估海洋环境健康状况的早期预警指标。热休克蛋白，是高度保守的蛋白质家族，广泛存在于所有生物细胞(包括原核细胞及真核细胞)内。其中，海洋双壳类HSP70家族成员对环境污染物有广泛的反应性，且反应灵敏，是一类理想的海洋环境污染的潜在预警分子。近江牡蛎广泛分布在近岸海域，是重要的海洋环境监测生物。我们以近江牡蛎为对象，采用荧光定量PCR技术研究了有机磷农药敌百虫诱导近江牡蛎潜在污染预警分子HSC70分子的表达情况。为了建立研究HSC70基因表达的荧光定量PCR技术，首先研究了β-actin、18S rRNA、GAPDH三种看家基因在近江牡蛎不同组织中的表达情况，以确定合适的内参基因，结果表明：β-actin在鳃、外套膜、消化腺、闭壳肌四种组织中均表达稳定，是一种理想的内参基因，而18S rRNA、GAPDH两种看家基因的表达则具有组织特异性，不适合作为内参基因使用。用不同浓度的敌百虫(0.5，0.2，0.05，0.01，0.001，0.0001 mg／l)处理近江牡蛎，分别于处理后3小时、7天、20天取样，研究闭壳肌、鳃、外套膜、消化腺等四种组织中HSC70的表达情况。荧光定量PCR技术研究表明，近江牡蛎在敌百虫处理后，其HSC70的表达具有组织特异性；本次试验中，0.5 mg／l的敌百虫不能诱导鳃、外套膜、消化腺中HSC70显著表达，但能够诱导闭壳肌中HSC70的显著低表达；外套膜中诱导HSC70显著表达的敌百虫临界浓度在0.001-0.0001 mg／l之间，消化腺和闭壳肌中在0.01-0.001 mg／l之间。极低浓度的敌百虫(0.0001 mg／l)仍然能够诱导鳃中HSC70显著高表达，表明HSC70对敌百虫的的刺激反应非常灵敏，也表明在本次研究的四种组织中，鳃对敌百虫反应最敏感，在生物监测时，是一种比较合适的组织材料。研究结果显示HSC70作为有机磷农药敌百虫的污染预警分子反应灵敏。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-7
目录  7-9
第一章前言  9-31
  1.1 生物标志物概述  10-18
    1.1.1 生物标志物体系  10-11
    1.1.2 生物标志物分类  11-13
    1.1.3 生物标志物的特性  13-14
    1.1.4 一些常用的生物标志物  14-18
  1.2 基因表达常规分析方法  18-29
    1.2.1 差异显示  19-20
    1.2.2 代表性差异分析  20-21
    1.2.3 表达序列标签  21
    1.2.4 基因表达序列分析  21-23
    1.2.5 微阵列技术  23-24
    1.2.6 Northern印迹  24-25
    1.2.7 核糖核酸酶保护试验  25-26
    1.2.8 半定量RT-PCR法  26
    1.2.9 实时荧光定量PCR  26-29
  1.3 本文的研究目的及意义  29-31
第二章荧光定量PCR检测HSC70表达方法的建立  31-49
  2.1 材料与方法  31-36
    2.1.1 实验动物及驯养  31
    2.1.2 药物  31
    2.1.3 实验仪器与试剂  31-33
    2.1.4 实验设计  33
    2.1.5 第一链cDNA的合成  33-34
    2.1.6 引物设计  34
    2.1.7 cDNA质量的检测  34-35
    2.1.8 引物扩增效率和特异性的确定  35
    2.1.9 看家基因的表达分析  35
    2.1.10 数据处理与分析  35-36
  2.2 结果  36-45
    2.2.1 总RNA的质量  36
    2.2.2 cDNA质量的检测  36-37
    2.2.3 引物扩增效率和特异性的确定  37-39
    2.2.4 看家基因的表达分析  39-45
  2.3 讨论  45-49
    2.3.1 产物特异性  45-46
    2.3.2 看家基因的表达  46-49
第三章敌百虫处理后近江牡蛎HSC70基因的表达定量  49-66
  3.1 材料与方法  49-50
    3.1.1 实验动物及驯养  49
    3.1.2 药物  49
    3.1.3 实验仪器与试剂  49
    3.1.4 材料处理及实验设计  49
    3.1.5 引物设计  49-50
    3.1.6 cDNA质量检测  50
    3.1.8 引物扩增效率和特异性的确定  50
    3.1.9 荧光定量PCR检测HSC70基因表达  50
    3.1.10 数据处理与分析  50
  3.2 结果  50-62
    3.2.1 引物扩增效率和特异性的确定  50-52
    3.2.2 HSC70基因的表达分析  52-62
  3.3 讨论  62-66
    3.3.1 引物扩增效率  62-63
    3.3.2 HSC70基因的表达情况  63-66
全文总结  66-67
参考文献  67-75
研究生期间发表论文情况  75-76
致谢  76

敌百虫诱导近江牡蛎（Crassostrea hongkongensis）HSC70基因表达的定量研究

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