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单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白B基因疫苗的构建及初步免疫学研究

作　者: 孟祥俊
导　师: 贺冰
学　校: 吉林大学
专　业: 眼科学
关键词: 单纯疱疹病毒I型糖蛋白B 角膜炎基因疫苗
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

单纯疱疹病毒性角膜炎（HSK）主要是由单纯疱疹病毒I型（HSV-1）直接感染角膜上皮细胞引起的点状或树枝状角膜炎；在角膜基质内发生的免疫反应，引起盘状、基质坏死性角膜炎；由于HSV-1的特性能够潜伏于三叉神经节造成复发感染, 在机体免疫力被抑制时，潜伏感染的HSV-1可重新活化，引起HSK的复发，由于HSK的反复发作造成视力严重损害甚至失明。目前针对HSK尚无特效疗法,从非选择性的竞争抑制病毒DNA酶的抗疱疹病毒类药物到比较有选择性病毒核苷激酶的抗HSV-1药物，再加上干扰素及不同类型的抗病毒药物的联合应用，使HSV-1的感染发生控制在较低的水平，但由于抗生素、激素的不合理使用，病毒耐药株的不断出现，机体的免疫功能受到干扰以及对HSV-1潜伏机制尚不清楚和一些药物全身应用时毒副作用，使其在临床应用时受到限制，迄今还未达到理想的治疗效果，故寻求特异性强、效果更好的抗病毒药物和研制抗HSV-1的安全疫苗来预防HSV-1的感染和复发,国内外许多学者认为针对HSV-1特异性自动免疫是控制感染的最有效途径。因此，研制疫苗是单纯疱疹病毒防治的重要方向。 HSV-1疫苗按其特点和作用机理可分为灭活病毒疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、肽疫苗、活载体疫苗、和核酸疫苗。核酸疫苗是近十年来发展起来的一种新的疫苗形式，可以诱导机体全面的细胞免疫和体液免疫应答，在胞内寄生病原体疫苗防治上具有广阔的应用前景。由于核酸疫苗是将抗原基因的质粒DNA直接导入体内，利用其表达的抗原蛋白诱导机体的免疫应答反应，因此必须将抗原编码基因克隆入表达载体中。核酸疫苗是由病原的保护性抗原基因和载体质粒构成；核酸疫苗的构建方法是将目的基因片段插入载体；插入基因片段是病原体保护性抗原的编码基因，其可以是单个基因、完整的一组基因，也可以是编码抗原决定簇的一段核苷酸序列，其表达产物为病原体有效的抗原部分，可诱发机体产生保护性免疫。本研究选用的是HSV-1 gB基因，gB糖蛋白就有较强的免疫原性，可诱<WP=57>导机体产生中和抗体和细胞免疫反应。gB糖蛋白是在感染细胞中含量最多的蛋白，是感染宿主细胞免疫和体液免疫的主要靶抗原，也是HSV-1特定细胞毒T淋巴细胞（CTL）主要靶抗原。小鼠接种重组形式的gB蛋白在体内产生中和HSV-1抗体，在腹膜内或脚蹼接种不同毒株具有完全免疫保护作用，保护小鼠不被致死剂量病毒致死，并且非常有效地抑制潜伏感染和复发感染的建立，与接种减毒活疫苗保护作用相似；gB蛋白诱导免疫保护作用具有长时效特点，明显保护三叉神经节免于感染；也有实验表明鼠接种分泌形式的gB蛋白对由HSV-1感染引起的角膜炎，脑膜炎和死亡具有明显保护作用；此外HSV-1 gB糖蛋白具有高度保守性，各毒株间差异较小，且与HSV-2病毒感染具有交叉保护作用。因此，HSV-1 gB糖蛋白是构建单纯疱疹病毒基因疫苗比较理想的侯选目的基因。本实验利用的载体是pcDNA3，主要有以下几部分构成：①来源于人类巨细胞病毒的早期启动子/增强子PCMV ，具有较强的表达下游基因的能力；②来源于牛生长激素基因的polA信号，以保证转录出的mRNA的稳定；③来源于大肠杆菌的ColEl，以便重组质粒在细菌中高拷贝复制；具备理想的哺乳动物细胞表达载体应具有的特点。本研究利用PCR技术从HSV-1 SM44株基因组中扩增出编码HSV-1 gB去除N端部分信号肽序列（39bp）的基因片断（2673bp），定向插入真核表达质粒pcDNA3载体中,构建出重组真核表达质粒pcDNA-gB，并对其进行酶切分析、PCR鉴定及测序分析；通过中和试验、ELISA方法及病毒攻击试验检测用pcDNA-gB三次肌肉接种小鼠的免疫效果。经过双酶切酶切分析、PCR鉴定及测序鉴定，我们可以确定该重组质粒构建成功，且HSV-1 gB的2673个碱基中仅有3个发生变异，碱基序列一致性达99.5%，与HSV-1不同毒株gB的序列也高度同源，同源性达99.0%；gB推测的氨基酸序列与HSV-1 F株的gB氨基酸序列比较，891个氨基酸中，有1个发生变异，且变异的碱基对HSV-1 gB N端糖基化部位、连续抗原表位无影响，其免疫原<WP=58>性应该不会受到影响。为了确定pcDNA-gB能否在动物体内正确表达及是否具有免疫保护作用，进行了初步的动物实验，利用pcDNA-gB免疫接种小鼠，经ELISA方法在小鼠血清中检测到了HSV-1特异性的抗体（抗体滴度：中和试验法1:41，ELISA法1:213），表明pcDNA-gB能够在小鼠体内表达gB蛋白；并诱导产生了特异性免疫应答，这种特异性的免疫应答减低了攻击病毒引起的小鼠死亡率（存活率80%），对小鼠具有良好的保护作用，与文献报道的一致，但是否能够防止发生潜伏感染尚需进一步研究。本实验已成功地构建了HSV-1 gB 基因疫苗，在初步动物实验中显示出对动物的免疫保护作用，可以成为防治HSV-1的候选疫苗；然而对于如何优化该DNA疫苗，我们还有大量的工作尚未开展，比如，最佳免疫剂量的摸索、免疫前的预处理等等。由于基因疫苗具有安全、稳定、制备简单、易于保存等特点，有希望成为防治HSV-1感染的主要疫苗。但是，基因疫苗的历史毕竟很短，实验结果均来自动物，在用于人体之前还有许多工作必须完成，其中最重要的是解决基因疫苗对人体的安全性和效

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英文缩写  6-7
提要  7-8
文献综述  8-20
  参考文献  17-20
第一章单纯疱疹病毒I型糖蛋白B 基因疫苗的构建  20-41
  前言  20-21
  材料与方法  21-28
  结果  28-35
  讨论  35-38
  结论  38-39
  参考文献  39-41
第二章单纯疱疹病毒I型糖蛋白B基因疫苗的初步免疫学研究  41-56
  前言  41-43
  材料与方法  43-46
  结果  46-48
  讨论  48-53
  结论  53-54
  参考文献  54-56
中文摘要  56-59
英文摘要  59-62
致谢  62

单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白B基因疫苗的构建及初步免疫学研究

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