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红豆草胰蛋白酶抑制剂性质的研究（续）与一级结构的测定

作　者: 侯新东
导　师: 喻梅辉；王颖
学　校: 新疆农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 红豆草蛋白酶抑制剂一级结构性质
分类号: Q946
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
下　载: 106次
引　用: 2次
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内容摘要

新疆红豆草胰蛋白酶抑制剂(简称OSTI)是1998年新发现的一种对Trypsin具有强烈抑制作用的蛋白质，发现后对其进行了初步的研究。在已有基础上，本论文着重对OSTI的性质（续）及其一级结构进行了深入探讨。研究内容及结果如下：研究红豆草胰蛋白酶抑制剂（OSTI）的分离纯化。采用硫酸铵盐析，FPLC. Mono S柱层析，得到了经PAGE电泳纯化的OSTI。用SDS-PAGE方法测得分子量为2.2万左右Da。研究OSTI的部分性质。以BAPNA为底物，在最适条件下，测定反应速度——酶量曲线，并进行比较，测定结果表明，OSTI对胰蛋白酶的抑制作用属不可逆抑制。以BAPNA为底物，测定反应最终OD值，根据OD值求出不同浓度抑制下的剩余活力。以OSTI的量为横坐标，酶剩余活力的百分比为纵坐标。通过计算得到OSTI对Trypsin抑制的摩尔比约为2，即1分子OSTI可抑制2分子Trypsin。以环己二酮对OSTI的Arg进行修饰，结果表明Arg是OSTI的活性中心氨基酸；用顺丁稀二酸酐对OSTI的Lys进行修饰，结果表明Lys也是OSTI的活性中心氨基酸。由此修饰结果可见OSTI有Arg 和Lys为中心的两个活性中心。测定OSTI的一级结构。该项测定是由本实验室提供测定样品，并由The Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research of Australia协助完成。采用MS测定蛋白质序列技术：即将PAGE干胶带转移到硝酸膜上，分别用Trypsin和V8酶切OSTI，经Hplc得到纯肽，然后采用Ms测定肽片段顺序，最后从不同蛋白酶酶切片段顺序中，找到重叠部分，经拼凑即得到整个OSTI序列。OSTI的一级结构由203个氨基酸残基组成，N端为Met，C端为Ala。将得到的序列与蛋白质结构库查对，OSTI序列与Kunitz-type Trypsin Inhibitor KTI2—Soybn同源性为88%。因此，OSTI是属于Kunitz这一家族的新成员。OSTI一级结构的确定为进一步获得其基因及其未来的深入开发应用奠定了重要基础。

全文目录

前言  11-14
一、文献综述  14-25
  1 蛋白酶抑制剂的研究简史  14
  2 蛋白酶抑制剂的研究现状及进展  14-21
    2.1 蛋白酶抑制剂在动植物中自然存在  14-15
    2.2 蛋白酶抑制剂的分类  15
    2.3 蛋白酶抑制剂结构和性质的研究  15-17
    2.4 蛋白酶抑制剂的作用与机理研究  17-19
    2.5 蛋白酶抑制剂功能的研究  19-21
  3 蛋白酶抑制剂在新疆的研究现状  21
  4 蛋白酶抑制剂的应用和前景........  21-25
二、实验部分  25-37
  1 材料、试剂、设备  25
    1.1 材料  25
    1.2 试剂  25
    1.3 设备  25
  2 实验方法  25-28
    2.1 红豆草胰蛋白酶抑制剂的分离纯化  25-26
    2.2 红豆草胰蛋白酶抑制剂一级结构的测定  26
    2.3 红豆草胰蛋白酶抑制剂的部分性质研究  26-28
      2.3.1 抑制剂抑制活力的测定(BAPNA法)  26
      2.3.2 抑制剂抑制活力的测定(BANA法)  26-27
      2.3.3 抑制剂抑制类型的测定  27
      2.3.4 摩尔抑制比的测定  27
      2.3.5 SH的修饰  27
      2.3.6 色氨酸残基的修饰  27
      2.3.7 精氨酸残基的修饰  27-28
      2.3.8 赖氨酸残基的修饰  28
  3 结果与分析  28-37
    3.1 红豆草胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及纯度鉴定  28-30
    3.2 红豆草胰蛋白酶抑制剂的一级结构  30-31
    3.3 抑制剂部分性质的研究  31-37
      3.3.1 抑制剂抑制类型的确定  31-32
      3.3.2 摩尔抑制比的确定  32-33
      3.3.3 精氨酸残基的修饰  33-34
      3.3.4 赖氨酸残基的修饰  34-37
三、讨论  37-38
四、结论  38-39
附录  39-40
参考文献  40-46

红豆草胰蛋白酶抑制剂性质的研究（续）与一级结构的测定

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