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苜蓿中华根瘤菌042BM与耐盐有关基因的克隆和初步分析

作　者: 解利石
导　师: 曾静；杨苏声
学　校: 中国农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 苜蓿中华根瘤菌 Tn5-1063a 渗透调节谷胱甘肽
分类号: Q785
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)042BM分离自新疆的和田苜蓿，能够在含0.6mol／LNaCl的FY基本培养基中生长。通过Tn5-1063a突变得到042BM的转座子插入突变株，从3000多个突变株中筛选到盐敏感突变株042BM-X1和042BM-X2。耐盐性实验表明，它们都不能在含0.4mol／L NaCl的固体FY培养基和0.5mol／L NaCl的液体FY培养基上生长。Southern杂交结果显示，Tn5在突变株基因组中以单拷贝形式插入，表明突变株的耐盐性下降与Tn5插入突变有关。使用质粒自连法克隆了042BM-X1和042BM-X2中Tn5插入位点的侧翼序列。通过EcoRI酶切突变株基因组，得到完整的Tn5(含有在大肠杆菌中起始复制的oriV)及其侧翼的序列片段，该片段自连后转化大肠杆菌，以Tn5两端已知的序列设计引物进行测序。BLAST的分析测序结果表明，042BM-X1和042BM-X2中Tn5分别定位在苜蓿中华根瘤菌1021染色体上SMc02682和SMc00419基因内部，本实验证明它们和042BM耐盐相关，命名为rst-0x1和rst-0x2基因。rst-0x1基因的功能未知，而rst-0x2基因和热带根瘤菌谷胱甘肽合成酶基因gshB有很高的同源性。 PCR扩增得到包含启动子的042BM rst-0x1和rst-0x2基因的全长。序列测定和BLAST分析表明，它们和苜蓿中华根瘤菌1021的相应基因有99％同源性，042BM的rst-0x1基因功能未知，而rst-0x2基因和热带根瘤菌谷胱甘肽合成酶基因gshB有81％同源性。从外源加入谷胱甘肽，能够部分恢复042BM-X2耐盐性，推测谷胱甘肽通过调节细胞内的钾离子浓度，在苜蓿中华根瘤菌042BM渗透胁迫反应中起重要作用。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-8
缩写  8-9
第一章文献综述  9-34
  1.1 细菌渗透调节概述  9-10
  1.2 亲合性溶质  10-11
  1.3 亲合性溶质的生物合成机制  11-15
  1.4 亲合性溶质的运输  15-21
  1.5 亲合性溶质的释放  21-25
  1.6 渗透调节的策略与过程  25-26
  1.7 与亲和性溶质积累无关的渗透胁迫反应  26-27
  1.8 全细胞调节因子σ~s  27-29
  1.9 转座子和转座子标签法  29-33
  1.10 本论文的研究思路与目标  33-34
第二章苜蓿中华根瘤菌042BM盐敏感菌株的获得及其验证  34-44
  2.1 前言  34
  2.2 材料和方法  34-41
  2.3 结果  41-43
    2.3.1 042BM盐敏感突变株的获得及其耐盐性分析  41-42
    2.3.2 盐敏感突变株中Tn5插入的验证  42-43
  2.4 讨论  43-44
第三章对042BM盐敏感突变株与耐盐有关基因的定位与分析  44-51
  3.1 前言  44
  3.2 材料与方法  44-47
  3.3 结果  47-50
    3.3.1 转座子Tn5插入位点的侧翼序列克隆  47-48
    3.3.2 042BM-X1中Tn5插入位点的侧翼序列分析  48-49
    3.3.3 042BM-X2中Tn5插入位点的侧翼序列分析  49-50
  3.4 讨论  50-51
第四章 PCR扩增042BM与耐盐相关基因及其功能研究  51-61
  4.1 前言  51
  4.2 材料与方法  51-53
  4.3 结果  53-59
    4.3.1 PCR扩增含有042BM rst-0x1基因及其启动子的DNA片段  53
    4.3.2 测序载体pGEM-0x1的构建及序列测定  53-56
    4.3.3 PCR扩增含有042BM rst-0x2基因及其启动子的DNA片段  56-57
    4.3.4 测序载体pGEM-0x2的构建和序列测定  57-58
    4.3.5 盐敏感突变株042BM-X2的生理功能测定  58-59
  4.4 讨论  59-61
结论  61-62
参考文献  62-73
致谢  73-74
作者简介  74

苜蓿中华根瘤菌042BM与耐盐有关基因的克隆和初步分析

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