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蛋白质C端序列分析方法学研究

作　者: 李军勇
导　师: 梁宋平；谢锦云
学　校: 湖南师范大学
专　业: 生物化学
关键词: 蛋白质C端测序标准氨基酸乙内酰硫脲(TH-AA) 偶联试剂三丁基硅异硫氰酸酯(TBuS-ITC) 三丁基锗异硫氰酸酯(TPGe-ITC)
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2001年
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内容摘要

蛋白质序列分析是蛋白质化学研究中的核心技术。运用Edman降解进行蛋白质N端顺序测定已成为十分完善的技术，并已经实现了自动化。C端与N端一样，在蛋白质分子结构分析中具有重要的地位，对其顺序测定具有重要的意义，不仅可以对N端封闭的蛋白质进行序列测定，而且对基因克隆有指导意义。纵观蛋白质C端测序方法的发展，由于化学法中的（异）硫氰酸法反应机理与Edman降解十分类似，方法，所以是最有前景的方法。然而，由于C端羧基的化学性质不活泼，致使Schlack-Kumpf降解法的研究进展缓慢。但通过近十年的研究表明该方法是很有希望成为常规C端顺序测定的方法。同时近十年来随着质谱技术的发展，使得质谱在分析大分子化学物质成为可能后，在蛋白质顺序分析领域里取得了很多重要进展。在蛋白质C端（异）硫氰酸法顺序测定技术中，标准氨基酸乙内酰硫脲（TH-AA）的制备是必须首先要解决的问题。本文以L-氨基酸为原料，采用乙酸酐作活化试剂，TMS-ITC作为偶联试剂，制备了19种TH-AA，另外TH-Pro的制备是用NH₄SCN作为偶联试剂获得成功的。反应产物通过RP-PHLC进行分离纯化，同时进一步用紫外光扫描进行鉴定。（异）硫氰酸法又称为Schlack-Kumpf降解，本文在关键的偶联试剂方面进行了不懈的努力，先后对理论上有可能成为偶联试剂的四种化学试剂进行了摸索，最后确定了其中两种是可行的：（1）三丁基硅异硫氰酸酯（TBuS-ITC）；（2）三苯基锗异硫氰酸酯（TPGe-ITC）。以上两种偶联试剂都是本文作者合成，并得到了质谱验证。测序过程包括：（1）用乙酸酐活化蛋白质和多肽C端羧基，形成蛋白质和多肽恶唑烷酮衍生物；（2）与偶联试剂发生偶联反应，生成蛋白质和多肽异硫氰酸酯衍生物，然后环化形成蛋白质乙内酰硫脲衍生物；（3）用摘要裂解试刘裂解得到缩短了一个氨基酸残基的多肤和C端氨基酸乙内酞硫服。木文采用合成的1（）肤（Nlx厂NYQKDALGFL一C00ll）和16肤(NI!2一K人KEsD人（;FLMFvYLv一eooll）为模型肤，并将其偶联到DITC玻璃珠上进行方法学研究。用TBus一1 Tc对10肤进行c端序列测定，成功地鉴定了其c端前4个氨基酸，初始回收率为53.106，重复回收率为5 7.6%。利用偶联到川 Tc玻璃珠上的10肤，对TPGe一1 TC作偶联试剂的活化剂用量、活化时间、偶联温度和偶联时间进行了优化，确定了最佳反应条件。然后以16肤为模型肤用优化的条件进行c端序列分析，取得了较好的一试骑结果，鉴定了该肤c端前8个氨基酸，其初始回收率为6‘.4%，重复回收率为79.6%。

全文目录

缩略表  3-5
中文摘要  5-7
英文摘要  7-10
第一章前言  10-17
第二章制备标准氨基酸乙内酰硫脲  17-28
  2.1 试剂与方法  17-20
  2.2 结果与分析  20-27
  2.3 讨论  27-28
第三章合成用于方法学研究的模型肽  28-40
  3.1 试剂与方法  28-34
  3.2 结果与分析  34-39
  3.3 讨论  39-40
第四章偶联试剂的探索  40-53
  4.1 偶联试剂探索之一  40-43
  4.2 偶联试剂探索之二  43-45
  4.3 偶联试剂探索之三  45-52
  4.4 偶联试剂探索之四  52-53
第五章三丁基锗异硫氰酸酯进行蛋白质C端序列分析  53-69
  5.1 试剂与方法  53-55
  5.2 结果与分析  55-66
  5.3 讨论  66-69
第六章设想与展望  69-71
参考文献  71-78
致谢  78-79

蛋白质C端序列分析方法学研究

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