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新疆杨转抗虫基因研究

作　者: 王婕琛
导　师: 诸葛强
学　校: 南京林业大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: 新疆杨 CpTI基因 根癌农杆菌 遗传转化 抗虫性
分类号: S792.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要


杨树是重要的速生用材树种之一，采用基因工程技术开展转基因杨树的研究，是培育抗逆、抗虫和抗病杨树新品种的有效途径。 本研究以新疆杨(Populus alba var.pyramidalis)为材料，开展了新疆杨组织培养植株再生及基因转化组培受体系统影响因素的研究。探讨了基本培养基、生长素、细胞分裂素、叶盘接种方式、抗生素等因素对新疆杨叶盘再生不定芽的影响。结果表明：生长素的种类与浓度对叶盘分化频率影响不显著；不同种类的细胞分裂素影响叶盘分化频率，其中极低浓度的TDZ可显著提高叶盘分化频率。并探讨了抗生素Cef及Km对叶盘分化的影响，研究显示：加入Km的时间显著影响叶盘对Km的本底抗性。建立了高效的新疆杨基因转化组培受体系统：1／2MS+TDZ 0.005mg／L+BA 0.25mg／L+IAA 0.5mg／L为最佳叶盘分化培养基，分化频率可达100％，平均分化芽数可达6.18；附加Km15mg／L+Cef50mg／L进行叶盘Km~r芽的筛选，叶柄附加Km25mg／L+Cef50mg／L进行筛选。 在建立的新疆杨转化组培受体系统基础上，研究了影响根癌农杆菌LBA4404介导的杨树遗传转化的7个因素：预培养时间、侵染时间、共培养时间、添加乙酰丁香酮(AS)的时机、共培养培养基中添加AS浓度、侵染菌液的制备方法、外植体状态。最终建立了高效的新疆杨遗传转化系统：预培养8小时，OD600=0.4左右农杆菌菌液侵染15分钟，共培养5天；侵染菌液的最优制备方法是液体培养活化农杆菌两次加离心收集菌体重悬；共培养培养基中添加AS80umol／L。在此转化体系下，新疆杨叶盘转化频率由6％增加到38.10％，提高了5倍。 利用此转化系统，采用双基因共转化法，未得到预期的转Bt基因植株和转双基因植株，仅获得了转CpTI(豇豆胰蛋白酶抑制剂)基因新疆杨植株。共获得96株Km~r植株，对其中的80株新疆杨Km~r植株进行了PCR检测，筛选得CpTI基因PCR阳性植株38株，占47.5％；在38个PCR阳性株系中选择了17个株系进行了斑点杂交检测，阳性株系有6个，占35.3％。在38个PCR阳性株系中选择了10个株系进行了饲虫实验，筛选到X46、X50两个株系对杨尺蠖幼虫的生长发育有较强的抑制作用，有进一步测试及推广的价值。部分转基因植株已移栽至苗圃，正在进行进一步检测分析。 采用菌种竞争性实验等三种方法，研究了未得到转Bt基因新疆杨植株的原因，初步推测可能是含有Bt基因或CpTI基因的两个菌株活力有明显差异。

全文目录


上篇 文献综述  9-17
  第一章 杨树基因工程研究的现状与展望  9-12
    1 杨树转化系统的选择策略  9
    2 影响杨树基因转化效率的因素  9-11
    3 杨树基因工程展望  11-12
  第二章 抗虫基因研究进展  12-14
    1 Bt毒蛋白基因  12
    2 蛋白酶抑制剂  12-13
    3 凝集素基因  13
    4 昆虫毒素基因  13
    5 胆固醇氧化酶基因  13
    6 营养杀虫蛋白基因  13-14
  第三章 新型选择标记基因和报告基因  14-17
    1 无选择标记基因植物转化系统  14
    2 选择标记基因  14-15
    3 报告基因  15-17
下篇 研究报告  17-61
  第一章 新疆杨组织培养植株再生及遗传转化受体体系的建立  17-26
    1 材料与方法  17-18
      1.1 植物材料  17
      1.2 培养基  17
      1.3 数据调查  17-18
      1.4 新疆杨抗生素敏感性试验  18
    2 结果与分析  18-24
      2.1 生长素对叶盘分化不定芽的影响  18
      2.2 细胞分裂素BA对叶盘分化不定芽的影响  18-19
      2.3 细胞分裂素ZT、KT对叶盘分化不定芽的影响  19-20
      2.4 新型细胞分裂素TDZ对叶盘分化不定芽的影响  20-21
      2.5 新疆杨叶盘分化抗生素敏感性测定  21-23
      2.6 新疆杨小植株生根抗生素敏感性测定  23
      2.7 壮苗与生根  23
      2.8 小结  23-24
    3 讨论  24-26
      3.1 多种分裂素配合使用与单独使用效果比较  24
      3.2 Km筛选浓度的相对可比性  24
      3.3 本底测试与转化操作间的时间差  24-26
  第二章 新疆杨农杆菌转化系统的优化和Km~r植株的获得  26-40
    1 实验材料  26-27
      1.1 植物受体材料  26
      1.2 试剂  26
      1.3 质粒和菌株  26
      1.4 培养基  26-27
    2 新疆杨根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化  27-29
      2.1 预培养  27
      2.2 正、负对照的设置  27
      2.3 农杆菌的活化和侵染菌液制备  27
      2.4 外植体的侵染和共培养  27-28
      2.5 影响根癌农杆菌转化新疆杨效果的因素  28
      2.6 分步筛选培养和Km~r植株的获得  28-29
    3 结果与分析  29-36
      3.1 预培养时间对产生Km~r芽的影响  29-30
      3.2 侵染时间对产生Km~r芽的影响  30-31
      3.3 共培养时间对产生Km~r芽的影响  31-32
      3.4 添加乙酰丁香酮对产生Km~r芽的影响  32-33
      3.5 共培养培养基中添加AS浓度对产生Km~r芽的影响  33-34
      3.6 侵染菌液的制备方法对产生Km~r芽的影响  34-35
      3.7 外植体状态对产生Km~r芽的影响  35
      3.8 分步筛选的效果  35-36
      3.9 小结  36
    4 讨论  36-40
      4.1 植物材料的生理状态  36
      4.2 优化转化系统的相对性和可行性  36-37
      4.3 影响转化效率的主要因素  37
      4.4 评价转化效率的指标  37-38
      4.5 选择转化体的不同策略  38-39
      4.6 得到非嵌和转基因植株的可能性  39-40
  第三章 新疆杨转基因植株的分子检测和饲虫实验  40-52
    1 实验材料  40
      1.1 植物受体材料  40
      1.2 酶及试剂盒  40
      1.3 质粒和菌株  40
      1.4 同位素  40
      1.5 引物  40
      1.6 昆虫幼虫  40
    2 实验方法  40-45
      2.1 新疆杨Km~r植株的分子检测  40-44
      2.2 新疆杨PCR阳性植株的饲虫实验  44
      2.3 新疆杨转基因植株的移栽  44-45
    3 结果与分析  45-50
      3.1 Km~r植株的PCR检测  45-46
      3.2 Km~r植株的PCR-Southern分析  46
      3.3 PCR阳性植株的Southern斑点杂交检测  46-47
      3.4 PCR阳性植株的Southern-blotting杂交检测  47-48
      3.5 PCR阳性植株饲虫实验  48-50
      3.6 新疆杨转基因植株的移栽  50
      3.7 小结  50
    4 讨论  50-52
      4.1 两种纯化DNA方法的优缺比较  50
      4.2 PCR两对引物扩增效果的比较  50-51
      4.3 虫试材料的选择  51
      4.4 转CpTI基因植株的抗虫效果  51-52
  第四章 菌株LBA4404(pFZY1)与LBA4404(pFWZ10)的活力差异  52-56
    1 实验材料  52
      1.1 植物受体材料  52
      1.2 质粒和菌株  52
    2 实验方法  52-53
      2.1 不同体积比混合两种菌株侵染新疆杨  52
      2.2 菌株生长曲线的测定  52
      2.3 菌株竞争性实验  52-53
    3 结果与分析  53-55
      3.1 不同体积比混合两种菌株进行侵染结果  53
      3.2 菌株LBA4404(pFZY1)和LBA4404(pFWZ10)生长曲线  53-54
      3.3 菌株竞争性培养  54-55
    4 讨论  55-56
  第五章 主要结论和进一步研究展望  56-57
  图版Ⅰ 新疆杨叶盘组培再生体系的建立  57-58
  图版Ⅱ 转CpTI基因新疆杨Km~r芽的分化及分步筛选  58-59
  图版Ⅲ 转CpTI基因新疆杨植株的获得和移栽  59-60
  图版Ⅳ 饲喂转基因植株叶片对幼虫生长发育的影响  60-61
参考文献  61-66

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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林树种 > 阔叶乔木 > 杨
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