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松乳菇及其分离菌株的RAPD-PCR分析研究

作　者: 齐向辉
导　师: 周国英
学　校: 中南林学院
专　业: 森林保护学
关键词: 松乳菇分离菌株 RAPD-PCR 相似系数聚类分析
分类号: S646
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

论文首次对松乳菇及其分离菌株进行了RAPD-PCR分析研究。采用筛选并改进的适宜于松乳菇及其分离菌株DNA抽提的四种不同方法，提取了来源于醴陵山区的松乳菇子实体及其通过本实验室组织分离并经摇瓶纯培养得到的5株菌株的基因组DNA，摸索出了一套松乳菇及其分离菌株DNA的高效提取方法——综合DNA抽提法。对松乳菇RAPD的反应体系及反应条件等进行了一系列的探索，并在此基础上对松乳菇及其分离菌株的DNA进行了分子水平上的鉴别研究，对分离菌株的稳定性进行了初步分析。实验对100条10bp的3’端随机引物进行了筛选，筛选出了条带清晰、重复性好的25条引物，并用这25条引物对松乳菇及其分离菌株的DNA进行了扩增，共获得185个扩增标记位点，平均每条引物7.4个。通过对松乳菇子实体及其分离培养菌株共6个样品DNA的遗传指纹图谱分析，统计出了它们之间的遗传相似系数，5个分离菌株与松乳菇子实体间的相似性性系数都比较高，在0.8000～0.9784之间。其中2号和3号菌株与1号样品(子实体)之间的DNA相似系数均在0.9351以上，尤其是2号和1号间相似系数高达0.9784。4号菌株是传代二次的松乳菇分离菌株，它与1号样品(子实体)之间的DNA相似系数为0.8541。5号和6号菌株是传代三次的松乳菇分离菌株，它们与子实体之间的DNA相似性系数分别为0.8000和0.8108，相似系数均比较高。相似系数的统计分析显示松乳菇子实体与分离菌株同种。同时以相似系数为依据，进行了UPMGA聚类分析，6株供试样品在0.8左右的相似水平上聚成一大类，聚类分析结果亦显示松乳菇子实体与5株分离菌株同种。从两种分析结果均可以判定5个分离菌株是松乳菇菌种(Lactarius deliciosus)。进一步根据相似系数及UPMGA聚类图分析了分离菌株的遗传稳定性，分析表明遗传变异是绝对的，而稳定性是相对的。本研究摸索出了一套松乳菇及其分离菌株DNA的高效提取方法，为松乳菇分离菌株的鉴别分析找到了一个便捷而又科学的新途径，并为松乳菇在分子生物学方面的进一步研究提供了参考和依据。

全文目录

中文摘要  5-6
前言  6-7
第一部分文献综述  7-17
  1 分子标记现状  7
  2 分子标记类型  7-10
    2.1 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性)  7-8
    2.2 RAPD(Randomly Amplified Polymorphic DNA，随机扩增的多态性DNA)  8
    2.3 AP-PCR(Arbitrary Primed-PCR，任意引物聚合酶链反应)  8
    2.4 AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性分析)  8-9
    2.5 SSR(Simple Sequence Repeat，简单重复序列)  9
    2.6 SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism，DNA单链构象多态性分析)  9
    2.7 mRNA DD(mRNA Differential Display，mRNA差异显示技术)  9-10
    2.8 SCAR(Sequence Characteristic Amplified Region，序列特性扩增区域)  10
  3 真菌分子标记应用研究进展  10-15
    3.1 分子标记在真菌分离菌株DNA分子鉴定方面的应用  10-11
    3.2 分子标记在人类真菌性疾病病原菌的分型及鉴定中的应用  11-12
    3.3 分子标记在基因定位、克隆和遗传图谱构建中的应用  12-13
    3.4 分子标记在真菌多样性研究等方面的应用  13-14
    3.5 分子标记在真菌遗传亲子分析方面的应用  14
    3.6 分子标记在研究线粒体遗传方面的应用  14-15
  4 真菌分子标记应用前景与展望  15
  5 本文选题的目的、意义与主要研究内容  15-17
    5.1 选题的目的意义  15-16
    5.2 论文的主要研究内容  16-17
      5.2.1 松乳菇子实体及其分离菌株DNA的提取及测定研究  16
      5.2.2 松乳菇子实体及其分离菌株DNA的RAPD-PCR扩增  16
      5.2.3 松乳茹子实体及其分离菌株DNA相似系数及聚类分析  16
      5.2.4 松乳菇分离菌株遗传稳定性分析  16-17
第二部分论文正文  17-35
  1 松乳菇子实体及其分离菌株DNA抽提及测定  17-23
    1.1 材料和方法  17-18
      1.1.1 实验材料  17
      1.1.2 仪器及试剂  17
      1.1.3 实验方法  17-18
        1.1.3.1 松乳菇及其分离菌株DNA的抽提方法  17-18
        1.1.3.2 松乳菇及其分离菌株DNA的测定  18
    1.2 结果与分析  18-21
      1.2.1 四种方法抽提松乳菇及其分离菌株DNA样品的测定结果  18-19
      1.2.2 松乳菇及其分离菌株四种DNA抽提方法的比较和结果分析  19-21
        1.2.2.1 松乳菇及其分离菌株的四种DNA抽提方法比较  19-20
        1.2.2.2 松乳菇DNA的抽提结果及电泳图谱比较  20-21
        1.2.2.3 松乳菇DNA的RAPD实验验证  21
    1.3 结论与讨论  21-23
      1.3.1 松乳菇及其分离菌株DNA抽提的最佳方法  22
      1.3.2 影响松乳菇及其分离菌株DNA抽提的因素  22
      1.3.3 松乳菇及其分离菌株DNA抽提操作时的注意事项  22-23
  2 松乳菇及其分离菌株的RAPD分子鉴别  23-34
    2.1 材料和方法  23-25
      2.1.1 实验材料  23
      2.1.2 仪器及试剂  23
      2.1.3 松乳菇及其分离菌株的RAPD实验方法  23-25
        2.1.3.1 DNA样品的稀释  23-24
        2.1.3.2 RAPD反应引物的筛选  24
        2.1.3.3 RAPD反应体系及反应条件  24
        2.1.3.4 RAPD扩增产物的检测  24-25
      2.1.4 RAPD实验数据统计方法  25
      2.1.5 松乳菇及其分离菌株的RAPD分析方法  25
    2.2 结果与分析  25-32
      2.2.1 松乳菇及其分离菌株的RAPD实验条件  25-29
        2.2.1.1 RAPD-PCR扩增体系  25-27
        2.2.1.2 RAPD-PCR扩增程序  27
        2.2.1.3 RAPD反应产物的电泳条件  27-29
      2.2.2 松乳菇及其分离菌株的RAPD分析  29-32
        2.2.2.1 RAPD引物筛选  29
        2.2.2.2 松乳菇及其分离菌株的RAPD扩增结果  29-30
        2.2.2.3 松乳菇及其分离菌株的RAPD相似性分析  30-31
        2.2.2.4 松乳菇及其分离菌株的RAPD聚类分析  31-32
        2.2.2.5 松乳菇分离菌株的遗传稳定性分析  32
    2.3 讨论  32-34
      2.3.1 松乳菇的RAPD引物  32
      2.3.2 松乳菇分离菌株的分子鉴别  32
      2.2.3 RAPD分子鉴别的技术范围  32-33
      2.3.4 RAPD分子鉴别的效果  33
      2.3.5 RAPD的重复性与稳定性  33-34
        2.3.5.1 影响RAPD重复性与稳定性的客观因素  33
        2.3.5.2 影响RAPD重复性与稳定性的主观因素  33
        2.3.5.3 松乳菇RAPD的重复性与稳定性  33-34
  3 小结  34-35
    3.1 松乳菇及其分离菌株的DNA抽提  34
    3.2 松乳菇及其分离菌株DNA的RAPD-PCR分析研究  34-35
参考文献  35-43
ABSTRACT  43-45
致谢  45

松乳菇及其分离菌株的RAPD-PCR分析研究

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