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血浆DNA分析用于非小细胞肺癌患者术后短期复发的预测

作　者: 穆原
导　师: 潘世扬
学　校: 南京医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 非小细胞肺癌复发血浆DNA DNA甲基化抑癌基因
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

背景在世界范围内,肺癌均已成为癌症死亡的主要原因,尽管手术对非小细胞肺癌(NSCLC)仍是有效治疗手段,但50%~90%的患者于术后2年内复发,90%~95%的患者于术后5年内复发。目前,对NSCLC患者术后复发缺乏有效的评估手段,主要依靠定期随访和影像学检查。如果能对经肺癌根治术的患者中存在复发高风险的部分加以准确的预测,通过尽早制定相应的个体化治疗方案,就可能改善肺癌患者的预后。因此,建立有效的NSCLC复发预测手段,对于肺癌患者的临床治疗就显得尤为重要。鉴于从单个肿瘤细胞生长成临床可检出肿瘤实体(目前临床上能最早发现大约直径在1 cm左右的肿瘤),需要经历相当长的一段时间,然而肿瘤在生长过程中,通过凋亡、坏死、自主释放等多种方式释放核酸至细胞外,最终被吸收进入外周血中,使得对循环核酸的测定能成为一种新的肿瘤诊断及预后评估手段。目的对Ⅰ~ⅢA期NSCLC患者手术前后血浆中的DNA及其APC、RASSF1A基因甲基化进行定量检测,以探讨其对术后复发的预测价值。方法54名NSCLC患者(Ⅰ~ⅢA期)来自2007年11月至2008年8月南京医科大学第一附属医院胸心外科,男38名,女16名,年龄38~79岁(中位年龄:63岁),分别于术前2~14 d(中位天数:6 d)及术后6~17 d(中位天数:8 d),采集肘静脉血,EDTA-K2抗凝,于室温1 600×g离心10min,上层血浆再于4℃16 000×g离心10min获得无细胞血浆,磁珠法提取血浆DNA,采用含内参照双重荧光定量PCR进行血浆DNA定量检测,以双重荧光定量MSP对APC及RASSF1A甲基化进行定量检测。所有患者于术后第6个月复查CT和体格检查,以确认复发情况。本院门诊体检健康者50名为对照,男30名,女20名,年龄36~77岁(中位年龄:58.5岁)。结果所有计量资料均为偏态分布,以中位数(四分位数区间)形式表示,54名患者有15名复发。对照组血浆DNA为18.3 (16.1~ 27.2) ng/ml,与性别及年龄均无关(P = 0.593,P = 0.270)。NSCLC患者血浆DNA术前为64.1 (46.4~79.3) ng/ml,术后为56.1 (41.9~90.6) ng/ml,较术前无显著变化,但均显著高于对照组(P < 0.001)。术前血浆DNA含量与年龄、肿瘤大小、淋巴结侵犯、AJCC分期、病理分型及分级均无关,而在性别间存在差异(P = 0.027),术后血浆DNA含量只与复发有关。APC甲基化水平在手术前后分别为401.8 (0~2 038.2)拷贝/ml和101.3 (0~1 060.0)拷贝/ml,术后显著低于术前(P = 0.016);RASSF1A甲基化水平术前为377.8 (0~1 283.9)拷贝/ml,术后有所降低,为0 (0~1 062.8)拷贝/ml,但未达到统计学差异(P = 0.060)。50例对照中共检出3例甲基化阳性,其中1例APC阳性(211.4拷贝/ml)、2例RASSF1A阳性(1例为218.0拷贝/ml,1例为338.5拷贝/ml),其甲基化水平远低于NSCLC患者(APC:P < 0.001;RASSF1A:P < 0.001)。血浆APC和RASSF1A甲基化水平在手术前后均显示与复发有关(术前APC:P = 0.001;术后APC:P < 0.001;术前RASSF1A:P < 0.001;术后RASSF1A:P < 0.001),而与年龄、性别、淋巴结侵犯、病理分型及分化级别均无关,其术后水平在不同AJCC分期间存在差异(APC:P = 0.020;RASSF1A:P = 0.022)。血浆DNA及其APC、RASSF1A甲基化水平在患者手术前后均显示出相同的变化模式,即未复发患者在术后降低而复发患者手术前后无显著改变,且术后此3项指标在复发患者均显著高于未复发患者。经ROC曲线分析,此3项指标对患者术后复发的预测效能,在术后显著优于术前(血浆DNA定量:P < 0.001;血浆APC甲基化定量:P = 0.011;血浆RASSF1A甲基化定量:P = 0.033)。分别以术后的血浆DNA≥73.3 ng/ml(敏感度:80.0%,特异度:82.0%)、APC甲基化≥810.7拷贝/ml(敏感度:86.7%,特异度:87.2%)及RASSF1A甲基化≥698.7拷贝/ml(敏感度:93.3%,特异度:89.7%)作为临界值,经logistic多因素分析,发现术后血浆RASSF1A甲基化水平是对NSCLC患者术后复发起显著作用的独立因素。结论术后6~17天的血浆DNA及其APC、RASSF1A甲基化定量检测,可对NSCLC患者术后6个月的早期复发进行预测,其预测价值显著优于术前血浆样本,远早于目前常用的临床检测手段,并以其较高的敏感度和特异度,及血液样本获得便利可多次取样用于动态观察等优势,有望成为NSCLC患者术后复发预测的新指标,其中血浆RASSF1A甲基化水平是对NSCLC患者术后复发起显著作用的独立因素,对其检测优于单项血浆DNA或APC基因甲基化的检测,其预后作用值得进一步探索。

全文目录

中文摘要  5-8
英文摘要  8-11
英文缩略词表  11-12
前言  12-40
  1 背景  15
  2 对象与方法  15-22
    2.1 研究对象  15-16
    2.2 仪器与试剂  16-18
    2.3 样本采集与处理  18
    2.4 甲基化定量检测标准品的制备  18-19
    2.5 磁珠法提取血浆 DNA  19-20
    2.6 血浆 DNA 定量检测  20-21
    2.7 DNA 的亚硫酸氢盐化学修饰  21-22
    2.8 血浆 APC 和 RASSF1A 基因双重荧光定量 MSP  22
    2.9 统计学分析  22
  3 结果  22-36
    3.1 研究对象的临床及病理资料  22-24
    3.2 血浆 APC 和 RASSF1A 基因双重荧光定量 MSP 检测方法的建立  24-26
    3.3 血浆 DNA 含量与临床病理参数间的关系  26-29
    3.4 血浆 APC 和 RASSF1A 基因甲基化水平与临床病理参数间的关系  29-32
    3.5 血浆 DNA 及其 APC、RASSF1A 甲基化定量对 NSCLC 患者术后复发的评估  32-34
    3.6 logistic 回归分析 NSCLC 患者的术后复发因素  34-36
  4 讨论  36-40
小结  40-41
参考文献  41-46
综述  46-56
  参考文献  52-56
附录  56-57
攻读学位期间发表文章情况  57-58
致谢  58

血浆DNA分析用于非小细胞肺癌患者术后短期复发的预测

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