|
背景和目的:随着人口的老龄化,老年性聋患者日渐增多,但至今老年性聋的发病机制尚不完全清楚。1964年Schuknecht根据外周听器的改变,将老年性聋分为感音型老年性聋、神经型老年性聋、代谢型老年性聋及机械型老年性聋,以此奠定了研究老年性聋的组织病理学基础。其中螺旋神经节细胞减少为神经型老年性聋的最基本病理改变。大量研究表明在老年性听力损失患者中普遍发现有螺旋神经节细胞的减少且通常伴纯音听阈下降,但螺旋神经节细胞丢失机制不清。自从1956年Harman提出衰老的自由基学说之后,国内外学者在各个领域对于老年性疾病进行了大量的研究并取得了重要的成果,该理论认为自由基可使细胞膜,线粒体膜过氧化及DNA损伤,从而引起细胞的死亡。在生物体内既有产生自由基的体系,又有清除自由基的体系,自由基在体内的生成与清除必须保持平衡,许多疾病都与其平衡失调有关。超氧化物歧化酶（SOD）能清除超氧阴离子自由基而起到保护细胞的作用,而脂质过氧化产物丙二醛（MDA）可使酶等带有氨基的化合物发生交联,丧失其活性,导致细胞膜结构和功能的损害。近年来的研究认为,在老年性聋的发生过程中,氧自由基不仅直接损伤耳蜗组织,还造成毛细胞DNA的损伤,加速细胞凋亡,从而引起耳蜗功能下降。转录因子NF-κB是介导许多免疫和炎症反应的中心物质,同时也是细胞凋亡信号通路中一个重要的转录调节因子。最近的研究表明自由基作为信号分子可激活NF-κB,激活后的NF-κB可以通过调节基因的转录从而调控细胞的凋亡。研究表明多种衰老性疾病都有NF-κB的激活,但老年性聋耳蜗中NF-κB的表达国内外还没有报道。也有研究表明衰老时自由基导致线粒体损伤,致能量代谢障碍,钙离子释出增多,形成氧化应激-Ca2+超载-氧化应激的恶性循环,导致神经细胞结构与功能的损伤。钙结合蛋白D28k（CalbindinD28k）在神经系统广泛分布,在维持细胞内游离钙水平、保持钙稳态上发挥重要作用,也就是说细胞内钙结合蛋白D28k的增加预示着钙离子内流的增加,关于老年性聋时耳蜗螺旋神经节钙结合蛋白D28k的表达变化国内未见报道。为了进一步探讨老年性聋时自由基对耳蜗的损伤机制,本课题以D-半乳糖衰老大鼠为研究对象,通过检测其血清超氧化物岐化酶（SOD）活力和丙二醛（MDA）浓度来了解体内氧化还原状态,用Maresch银反应法染色观察耳蜗螺旋神经节神经元的形态学变化,用免疫组化方法观察耳蜗螺旋神经节NF-κBp50,caspase-3,CalbindinD28k的表达变化并分析其意义,为临床预防和治疗老年性聋提供理论依据。材料与方法:1.以成年大鼠为研究对象,将60只健康、耳廓反射灵敏的Wistar大鼠,随机分为两组:实验组和对照组,每组30只。实验组每天腹腔注射D-半乳糖300mg/kg,每天2次,连续4周,对照组每天腹腔注射同等量的生理盐水,连续4周。2.各组动物于用药前和用药后用黄嘌呤氧化酶法测定大鼠血清SOD活力,硫代巴比妥酸比色法测定MDA浓度.3.各组动物均于用药前和用药后测试听性脑干反应阈值,Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波潜伏期及Ⅰ-Ⅲ、Ⅲ-Ⅴ、Ⅰ-Ⅴ波间期。4.各组动物于用药前和用药后采用Maresch银反应法染色观察耳蜗螺旋神经节神经元的形态变化。5.大鼠以10%盐酸氯胺酮（100mg/kg）腹腔注射麻醉,全身麻醉后取仰卧位固定,打开胸腔,显露心脏,剪开右心耳,依次用生理盐水和4%多聚甲醛PBS固定液（0.1M,pH7.4）经左心室进行半身灌注后处死（钳夹腹主动脉）,至大鼠前肢僵硬,鼻孔溢液,迅速断头,快速取出听泡并去除大部分听泡外侧骨质,于解剖显微镜下用细针挑去听骨及鼓膜,蜗尖钻孔,开放圆窗和卵圆窗,再以4%多聚甲醛PBS固定液从两窗和蜗尖灌流5次,最后将标本置于同一固定液中于4℃冰箱内过夜。第二天取出标本,用0.1 M PBS（pH 7.4）反复冲洗后置入10%EDTA（pH 7.4）中脱钙,然后石蜡包埋,连续切片。切片机上行耳蜗组织轴位切片,厚度为4-5um,每一耳蜗于近蜗中轴处切片5张（一张行Maresch银反应法染色,三张用SP法进NF-κBp50,caspase-3,钙结合蛋白D28k免疫组织化学染色,另一张做阴性对照）。6.用德国Leica计算机图像处理系统进行图像分析,测定NF-κBp50,caspase-3,CalbindinD28k阳性反应产物的IOD值（积分光密度）,按此结果比较它们含量的多少。7.实验数据经SPSS10.0统计软件进行统计学处理,采用t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。结果:1.对照组用药后ABR反应阈值,Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波潜伏期及Ⅰ-Ⅲ、Ⅲ-Ⅴ、Ⅰ-Ⅴ波间期无明显改变。实验组用药后ABR反应阈值明显提高,Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波潜伏期明显延长,Ⅰ-Ⅲ、Ⅲ-Ⅴ、Ⅰ-Ⅴ波间期亦明显延长,两组均值差异有统计学意义（P＜0.05）。2.实验组大鼠血浆SOD含量较对照组降低,MDA含量较对照组增高,差异均有统计学意义（P＜0.05）。3.Maresch银反应法染色光镜下显示,实验组大鼠耳蜗螺旋神经节细胞减少,细胞内可见大量脂褐素沉积,而对照组螺旋神经节细胞排列致密,均匀一致,少见黄褐色颗粒。4.图像分析系统显示耳蜗螺旋神经节NF-κBp50,caspase-3,CalbindinD28k免疫组织化学阳性反应物的IOD值实验组比对照组大,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:1老年大鼠耳蜗螺旋神经节细胞减少,大量脂褐素沉积且caspase-3的表达增强,提示存在变性和凋亡。2老年大鼠耳蜗螺旋神经节细胞内CalbindinD-28k增高,可能存在钙离子内流增加。3老年大鼠耳蜗螺旋神经节细胞NF-κB p50的活性增加,可能与细胞的存活有关。
|