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五指山原始林区土壤稀有放线菌的初步调查

作　者: 李载渊
导　师: 曾会才
学　校: 海南大学
专　业: 微生物
关键词: 稀有放线菌分离鉴定抑菌活性
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

五指山位于海南岛中部,北纬18°45’20"-18°58’54",东经109°39’38"-109°47’50",主峰位于五指山市境内,最高峰海拔高度1867米,属国家自然保护区的面积134.4平方公里,为海南最大的自然保护区,是世界上现存地势最高的原始热带雨林之一,蕴藏着极其丰富的稀有放线菌资源,至今仍然未开发利用。我们对五指山原始林区不同海拔高度和不同植被生境的土壤样品的稀有放线菌进行了分离、初步鉴定及以香蕉枯萎镰刀菌4号小种(Fusaium oxysporum f.sp.cubense race 4)为对象进行了抑菌效果初步评价,旨在发现稀有放线菌新属、新种,获得对香蕉枯萎镰刀菌病害具良好抑菌效果的稀有放线菌菌株。初步研究结果如下：一、采用稀释平板法,主要选取HV、葡萄糖天门冬素、甘油天门冬素和土壤浸汁四种选择性培养基(每种培养基上均含有20mg/L的制霉菌素、20mg/L放线菌酮及50mg/L的重铬酸钾),结合苯酚、SDS、干热和超声波四种不同的预处理方法,共从五指山原始林区不同海拔高度不同生境的116份土样中分离得到702株稀有放线菌,其中以苯酚预处理后再涂布于HV琼脂上分离得到的稀有放线菌最多。二、对不同海拔高度分离到的稀有放线菌数量进行统计分析,发现稀有放线菌的数量随海拔高度的升高而降低；同时我们还发现不同生境样品中分离得到的稀有放线菌的数量也是不一样的。三、根据气生菌丝有无、菌落的颜色、生长及形态的观察,产水溶性色素的情况等,将702株稀有放线菌划分为14个类群。四、从上述14个类群中挑选26株稀有放线菌进行了形态观察和16S rRNA基因序列分析,结果显示此26株菌分别为小单孢菌属,冢村菌属,小双孢菌属,指孢囊菌属,野村菌属,游动四孢属,Luedemannella及Streptosporangiaceae str.,其中以小单孢菌属为主。五、以香蕉枯萎病菌4号小种为抑制对象,对702株稀有放线菌进行抑菌活性初步测定和筛选,发现菌株210-1-61具有较强的拮抗活性,抑菌距离达8.2mm。六、对拮抗菌210-1-61进行鉴定,通过形态特征及16S rDNA序列分析,再通过生理生化等多项特征与相关近缘种属比较,我们将其鉴定为小单孢菌属,与Micromonospora pattaloongensis JCM12833T亲缘关系最近。七、对菌株119-1-07的进行初步鉴定,发现其形态特征与Luedemannella flava7-40(26)T较为相似；且其16SrDNA序列相似性与Luedemannella flava 7-40(26)T最高,为97.2%,并其能在进化树上与Luedemannella形成一个稳定独立的分枝；但其培养特征及生理生化特性与Luedemannella flava 7-40(26)T则有一定的差异。因此,119-1-07极为可能是Luedemannella属的一个新种。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-11
1 前言  11-33
  1.1 稀有放线菌的分离  11-16
    1.1.1 稀有放线菌的生态分布及样品的选择  11-12
    1.1.2 样品的预处理方法  12-14
    1.1.3 分离培养基及抑制剂的选择  14-16
    1.1.4 土壤放线菌分离方法的选择  16
    1.1.5 分离过程中培养条件的选择  16
  1.2 稀有放线菌研究及其分类鉴定技术  16-26
    1.2.1 稀有放线菌在微生物系统中的地位  16-22
    1.2.2 放线菌的分类鉴定  22-26
      1.2.2.1 放线菌分类研究方法的发展简史  22
      1.2.2.2 放线菌的传统分类方法  22-23
      1.2.2.3 化学鉴定方法  23-24
      1.2.2.4 放线菌的分子分类  24-25
      1.2.2.5 多相分类鉴定  25-26
  1.3 稀有放线菌应用研究  26-31
    1.3.1 稀有放线菌抗生素的研究  26-28
    1.3.2 稀有放线菌其他生物活性  28-29
    1.3.3 放线菌与植物病害防治  29-31
      1.3.3.1 放线菌防治植物病害的机制  29-31
      1.3.3.2 放线菌与香蕉枯萎病的生物防治  31
  1.4 论文的设计思路  31-33
2 材料与方法  33-44
  2.1 材料  33-35
    2.1.1 土壤样品  33
    2.1.2 培养基  33-34
    2.1.3 拮抗试验供试靶标菌  34
    2.1.4 主要药品和试剂  34
    2.1.5 主要溶液的配置  34-35
    2.1.6 主要仪器  35
  2.2 方法  35-44
    2.2.1 土壤放线菌的分离  35-37
      2.2.1.1 样品采样方法  35-36
      2.2.1.2 稀有放线菌的选择性分离技术路线  36
      2.2.1.3 各种样品预处理方法  36
      2.2.1.4 土样稀释液的制备  36
      2.2.1.5 土样中放线菌的分离、纯化及保藏  36-37
    2.2.2 稀有放线菌拮抗香蕉枯萎镰刀菌活性测定  37
    2.2.3 根据颜色和菌落形态分群  37
    2.2.4 放线菌形态鉴定  37-38
    2.2.5 生理生化特征的测定方法  38-39
      2.2.5.1 产H2S实验  38
      2.2.5.2 淀粉水解实验  38
      2.2.5.3 牛奶的凝固和胨化实验  38
      2.2.5.4 各种碳源的利用  38-39
    2.2.6 放线菌的16S rDNA序列分析  39-44
3 结果与分析  44-60
  3.1 五指山原始林区稀有放线菌的选择性分离结果  44-46
    3.1.1 分离方法对稀有放线菌分离的影响  44-45
    3.1.2 不同生境的土壤稀有放线菌分离  45-46
  3.2 不同海拔高度对稀有放线菌数量的影响  46-47
  3.3 拮抗稀有放线菌的筛选  47
  3.4 分离到的菌株初步分类归属  47-52
    3.4.1 稀有放线菌的形态分类  48
    3.4.2 代表菌株的系统发育分析  48-52
      3.4.2.1 26株代表菌株16S rDNA的获取  48-49
      3.4.2.2 26株代表稀有稀有放线菌的初步归属  49
      3.4.2.3 26株代表稀有放线菌的16srDNA聚类分析  49-52
  3.5 拮抗菌株210-1-61的初步鉴定  52-56
    3.5.1 菌株210-1-61形态特征  52-53
    3.5.2 菌株210-1-61形态特征及其培养特征  53
    3.5.3 菌株210-1-61生理生化特性  53-54
    3.5.4 菌株210-1-61 16S rDNA序列分析  54-55
    3.5.5 菌株210-1-61的16srDNA聚类分析  55-56
  3.6 菌株119-1-07的初步鉴定  56-60
    3.6.1 菌株119-1-07形态特征  56
    3.6.2 菌株119-1-07的培养特征  56-57
    3.6.3 菌株119-1-07生理生化特征  57-58
    3.6.4 菌株119-1-07的16SrDNA聚类分析  58-60
4 讨论  60-63
  4.1 关于土壤稀有放线菌的选择性分离方法的问题  60
  4.2 关于稀有放线菌分布的问题  60
  4.3 关于拮抗放线菌的初步筛选问题  60-61
  4.4 关于放线菌的鉴定  61
  4.5 研究的前景及需要进一步解决的问题  61-63
5 结论  63-64
参考文献  64-70
附录  70-85
致谢  85

五指山原始林区土壤稀有放线菌的初步调查

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