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盐酸四环素单克隆抗体的制备及其初步应用研究

作　者: 魏丽丽
导　师: 彭远义
学　校: 西南大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 盐酸四环素 单克隆抗体 ELISA
分类号: S859.84
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 237次
引　用: 2次
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内容摘要


四环素类药物（tetracyclines，TCs）抗菌谱广、疗效好，已经广泛应用于各种感染疾病的治疗。但近年来其在动物组织中的残留危害已经引起了人们的高度关注，同时其检测方法也在不断的改进，目前国内还没有见到利用四环素单克隆抗体建立四环素残留检测方法的正式报道。因此，本研究在查阅大量资料的基础上制备了盐酸四环素单克隆抗体，建立了四环素残留的免疫学检测方法，为试剂盒的开发应用奠定了基础。试验结果如下：1．采用重氮法合成了TC-BSA、TC-OVA，通过紫外扫描对人工抗原进行鉴定。紫外扫描图谱显示TC-BSA和TC-OVA分别在276.6nm和278nm波长处有最大吸收峰，此外还有TC特征峰，进一步说明半抗原TC已分别与载体BSA和OVA交联。2．以TC-BSA作为免疫抗原，免疫8周龄BALB／C系小鼠。三免后，将小鼠断尾采血分离血清，以TC-OVA为包被抗原，用间接ELISA法和间接竞争ELISA法筛选血清效价高且特异性强的阳性鼠。取阳性小鼠的脾细胞与SP2／0细胞用50％PEG-1500进行融合。通过检测、克隆、筛选等步骤，最终筛选出两株产抗TC单抗的细胞株，并对细胞的培养上清液进行单抗亚型鉴定，表明两株细胞所产单抗为IgG2b型抗体。将一株杂交瘤细胞注射小鼠腹腔产生腹水，并将腹水用辛酸-硫酸胺法纯化，纯化后腹水的蛋白含量为1.326mg／mL，然后用SDS-PAGE进行纯度鉴定，电泳结果为两条清晰的条带，一条为重链，一条为轻链，纯度较高。3．应用纯化后的单抗初步建立间接竞争ELISA法，用方阵滴定法确定了抗原最佳包被浓度（5μg／mL）、单抗纯化后的工作浓度为1∶8000，并对其整个反应体系的反应条件进行了优化，以此建立了TC残留的ELISA检测方法；绘制了TC对E10细胞株所产单克隆抗体的抑制曲线，标准曲线为y=-20.439x+81.03（R2=0.9498），检测限（LOD）为0.68ng／mL，IC50为31.62ng／mL；TC单克隆抗体与环丙沙星、氧氟沙星、庆大霉素、青霉素钾、磺胺嘧啶、链霉素六种药物均无交叉反应性。结果表明，试验建立的TC残留检测的ELISA方法灵敏度高、特异性好。4．将盐酸四环素系列浓度药物添加到牛奶中，然后作其标准曲线，建立其回归方程；再分别取高、中、低3个盐酸四环素药物浓度作回收试验，采取与标准曲线相同的样品处理方法，得到盐酸四环素在牛奶中的添加回收率在61.3％-76.5％之间。结果表明：应用TC单抗建立的间接竞争ELISA方法能用于检测牛奶中四环素的残留。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
第1章 文献综述  10-21
  1.1 兽药残留概况  10-15
    1.1.1 兽药物残留的危害  10-11
    1.1.2 兽药残留的成因  11-12
    1.1.3 兽药残留的种类  12
    1.1.4 兽药残留的国内监控概况  12-14
    1.1.5 兽药残留的国外监控概况  14-15
  1.2 四环素类抗生素的研究进展  15-21
    1.2.1 结构与性质  15-16
    1.2.2 抗菌机制及耐药机制  16
    1.2.3 不良反应  16-17
    1.2.4 药动学概况  17
    1.2.5 残留检测方法概况  17-21
第2章 引言  21-23
  2.1 研究的目的意义  21
  2.2 研究的主要内容  21-22
  2.3 技术路线  22-23
第3章 抗盐酸四环素单克隆抗体的研制  23-39
  3.1 材料与方法  23-30
  3.2 结果与分析  30-35
    3.2.1 人工抗原的合成与鉴定  30-32
    3.2.2 间接 ELISA 检测方法的建立  32-33
    3.2.3 细胞融合及培养  33
    3.2.4 阳性杂交瘤细胞上清液特异性鉴定  33
    3.2.5 单克隆抗体的冻存与复苏  33-34
    3.2.6 单克隆抗体的大量制备  34
    3.2.7 单克隆抗体的亚型鉴定  34
    3.2.8 SDS-PAGE 电泳检测单克隆抗体纯度  34-35
    3.2.9 腹水纯化后蛋白含量的测定  35
  3.3 讨论  35-39
    3.3.1 人工抗原的合成与鉴定  35
    3.3.2 动物免疫  35-36
    3.3.3 间接 ELISA 方法的建立  36-37
    3.3.4 细胞融合  37-38
    3.3.5 阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆  38
    3.3.6 单克隆抗体的大量制备及提纯  38-39
第4章 抗盐酸四环素单克隆抗体的初步应用  39-47
  4.1 材料与方法  39-41
  4.2 结果与分析  41-45
    4.2.1 TC 残留 ELISA 检测方法的建立  41-43
    4.2.2 灵敏度试验  43-44
    4.2.3 特异性试验  44
    4.2.4 样品添加回收率的测定  44-45
  4.3 讨论  45-47
    4.3.1 盐酸四环素 ELISA 方法条件的优化  45
    4.3.2 灵敏度试验  45-46
    4.3.3 特异性试验  46
    4.3.4 样本添加试验  46-47
第5章 小结  47-48
  5.1 人工抗原的合成  47
  5.2 盐酸四环素单克隆抗体的制备  47
  5.3 盐酸四环素单克隆抗体的初步应用研究  47-48
参考文献  48-52
致谢  52-53
在学期间所发表的文章  53

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医药物学 > 兽医毒物学 > 动物性食品中化学物残留
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