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CEL I的分离及水稻TILLING突变库的创建

作　者: 孙洁
导　师: 崔海瑞
学　校: 浙江大学
专　业: 生物物理学
关键词: CELI提取点突变检测突变体库 TILLING 水稻
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

TILLING是一种新的反向遗传学研究技术，它将特异性碱基错配识别酶和PCR技术结合起来对诱发突变或自然变异进行检测。该技术不仅可应用于模式植物，而且可应用于重要的农作物，在水稻中具有广阔的应用前景。CELⅠ是TILLING检测点突变所需要的一个关键酶，而突变库则是开展TILLING研究必不可少的。本文首次分析了几种不同因素对芹菜CELⅠ核酸酶提取量的影响，并建立了籼稻品种9311的突变库，为进一步开展水稻TILLING研究奠定了基础。分析了品种、器官、发育时期和提取缓冲液pH值等因素对芹菜CELⅠ提取量的影响。不同芹菜品种和器官的CELⅠ提取量具有明显的差异，在所用的3个不同品种中，泰国芹的CELⅠ核酸酶提取量最高（52.4μg／100g），文图拉次之（42.1μg／100g），雪白芹则最低（30.9μg／100g）；而在同一品种的3个不同器官中，则表现为叶＞茎＞根，不同品种间和不同器官间的CELⅠ提取量差异分别达到了显著和极显著水平。以上海黄心芹为材料比较了发育时期对提取量的影响，生殖生长期植株的CELⅠ核酸酶提取量明显高于营养生长期。此外，缓冲液pH值对CELⅠ提取量也有明显的影响，在pH 7.7的缓冲液提取环境下，CELⅠ核酸酶提取量明显高于pn 5.0和pH 9.0的环境。该研究结果有助于建立高效的CELⅠ提取方法。对CELⅠ酶的粗提物的活性检测进行了研究。错配切割实验表明，CELⅠ酶能有效地在eGFP基因中错配位点进行切割，并可以通过琼脂糖凝胶电泳获得直观的检测结果，从而可以用于TILLING分析。该研究结果对于建立简易而又有效的点突变检测方法具有重要的意义。用化学诱变剂EMS对籼稻品种9311进行了诱变处理，构建了突变体库。在M₂代对各种突变性状进行了观察和记载。在887个家系中，共发现了1683个突变株，分布于696个突变家系中。EMS诱发突变类型丰富，突变性状涉及到叶片、茎杆、穗部、生育期、生理性状等多种类型。已筛选到EMS诱变产生的突变体1472份，其中有些突变体是以往同类研究中所没有报道的，如短剑叶突变体和有色米突变体。对矮杆突变体的各节间长度和有色米突变体的生物学性状（叶长、叶宽等）、主要农艺性状和主要品质性状做了进一步的分析。此外，还采用改良的CTAB法提取了M₂群体的各单株DNA，并按8个1组构建了约1000个DNA池。新构建的突变体库为开展水稻TILLING探究奠定了基础。本文的研究结果对进一步利用TILLING技术进行水稻功能基因组学研究和品种改良具有重要的意义。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-11
第一章文献综述  11-31
  1 基因点突变及其检测  11-16
    1.1 点突变的概念及其性质  11-12
    1.2 SNP的检测技术  12-16
      1.2.1 SNP的主要检测方法  12-14
      1.2.2 SNP的酶学检测  14-15
      1.2.3 CEL I对错配碱基的剪切  15-16
  2 TILLING技术及其应用进展  16-24
    2.1 TILLING技术的基本原理与操作流程  16-17
    2.2 TILLING的技术核心与特点  17-19
      2.2.1 TILLING技术的核心  17-18
      2.2.2 TILLING技术的特点  18-19
    2.3 TILLING技术的应用  19-24
      2.3.1 在突变特性研究中的应用  19-20
      2.3.2 在SNP检测和发掘中的应用  20
      2.3.3 在反向遗传学和功能基因组学中的应用  20-22
      2.3.4 在资源分析中的应用——Ecotilling  22-23
      2.3.5 在创造突变资源和作物品种改良中的应用  23-24
  3 本文的研究内容与意义  24-31
    3.1 研究的目的和意义  24
    3.2 研究内容  24-31
      3.2.1 不同因素对CEL I提取的影响  24-25
      3.2.2 CEL I在点突变检测中的应用  25
      3.2.3 水稻TILLING研究突变库的建立  25-31
第二章不同因素对CEL I提取的影响  31-39
  1 材料与方法  31-33
    1.1 植物实验材料  31-32
    1.2 样品采集  32
    1.3 CEL I核酸酶的提取  32-33
    1.4 CELI 提取物的SDS-PAGE与提取量的估算  33
  2 结果与分析  33-36
    2.1 不同品种和不同器官中CEL I核酸酶提取量的差异  33-35
    2.2 不同发育时期对CEL I核酸酶提取量的影响  35-36
    2.3 不同pH值缓冲液对CEL I核酸酶提取量的影响  36
  3 讨论  36-39
第三章 CEL I在点突变检测中的应用  39-44
  1 材料与方法  39-41
    1.1 供试材料  39-40
      1.1.1 CEL I提取物  39
      1.1.2 含点突变的DNA片段  39-40
    1.2 用于酶切的PCR扩增及扩增后处理  40-41
    1.3 酶切反应及后处理  41
    1.4 电泳检测  41
  2 结果分析  41-44
第四章水稻TILLING研究突变库的创建  44-64
  1 材料与方法  45-48
    1.1 供试材料  45
    1.2 化学诱变处理  45
    1.3 M_1代种植与收获  45-46
    1.4 M_2代种植与收获  46
    1.5 DNA提取  46-47
    1.6 性状考察  47
    1.7 品质性状的测定  47
    1.8 部分性状突变的确定  47-48
    1.9 米色突变株的PCR分析  48
  2 结果与分析  48-50
    2.1 M_1诱变生物学效应  48
    2.2 M_2代的田间表现与突变分离  48-50
  3 突变体特性  50-60
    3.1 叶片性状突变体  50-53
      3.1.1 叶色突变  50-52
      3.1.2 叶型突变  52
      3.1.3 叶鞘突变  52-53
      3.1.4 草状突变  53
    3.2 株高变异  53-55
      3.2.1 高杆突变  53-54
      3.2.2 矮杆突变  54-55
    3.3 植株分蘖数目变异  55-56
    3.4 生理性状突变  56-57
      3.4.1 育性突变  56
      3.4.2 不抽穗突变  56
      3.4.3 成熟期突变  56-57
    3.5 穗部突变  57-58
      3.5.1 芒性突变  57
      3.5.2 颖壳性状突变  57-58
    3.6 米色突变  58-60
      3.6.1 突变株的田间表现  58-59
      3.6.2 米色突变株的品质性状分析  59-60
      3.6.3 米色突变体的基因分析  60
  4 水稻突变体DNA库的建立  60-61
  5 讨论  61-64
附录  64

CEL I的分离及水稻TILLING突变库的创建

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