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能产辅酶Q_（10）的土壤根瘤杆菌菌株选育及其发酵条件优化

作　者: 郝振华
导　师: 梅乐和
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化工
关键词: 土壤根瘤杆菌 辅酶Q10 诱变育种 Plackett-Burman设计 均匀试验设计 二次饱和D-最优试验设计 正交试验 溶氧
分类号: TQ464.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


辅酶Q10(Ubidecarenone，conezyme Q10)，又名泛醌，是呼吸链中一种重要的递氢体。辅酶Q10具有抗氧化、防衰老、提高机体免疫力等功能，被广泛用于各类心脏病，高血压、肝炎等疾病的治疗。本文对产辅酶Q10的菌种选育和发酵过程进行了初步研究。研究了辅酶Q10的定量分析方法：Craven试验显色法和高效液相色谱法（HPLC）。将Craven反应的溶剂改进为丙酮，使该反应的灵敏度提高了近50％。该方法特异性强，操作简单，可在短时问内测定大批样品；确立了HPLC法测定辅酶Q10条件和相应标准曲线，测定方法准确可靠。研究了可以批量提取样品中辅酶Q10的化学破胞方法，工艺路线为EDTA预处理→NaOH作用破胞→丙酮抽提萃取。通过Plackett-Burman设计试验和最终优化实验得到较佳的提取工艺条件：0.1mol／L EDTA作用温度为30℃，1ml发酵液中2mol／L NaOH用量和生物量的关系为V=4.335m，R2=0.971，其作用时间和温度分别为50min和52℃。与碱醇皂化、高压匀浆等方法提取结果比较，化学破胞方法因其条件温和、破胞彻底而提取效果更好。以土壤根瘤杆菌AT-hh01为出发菌株，确定了紫外诱变的最佳条件：30W紫外灯，诱变距离为65cm，照射时间为20s；60Coγ射线诱变的较佳诱变剂量为300 Gy。经过多轮γ射线和紫外诱变，在亮氨酸和D—半乳糖的复合筛选平板中筛选得到了一株突变菌株AT-hh1201-4，辅酶Q10产量为27.2mg／L，较出发菌株AT-hh01提高了51.96％，经过传代10次，证明其遗传性状稳定。对土壤根瘤杆菌AT-hh1201-4的摇瓶培养及制备辅酶Q10过程进行了优化。通过考察不同的碳源、氮源对辅酶Q10产量的影响，确定了较好的碳源为葡萄糖和蔗糖，氮源为酵母膏和（NH4）2SO4。以均匀试验设计对Plackett-Burman设计试验筛选所得关键因素一酵母膏、（NH4）2SO4和种龄作了进一步优化，采用二次多项式逐步回归的方法对结果进行拟合，获得优化化条件为：酵母膏46.2g／L，（NH4）2SO425.4g／L，种龄为24h，经实验验证，回归拟合结果较好。经优化后辅酶Q10的平均产量为32.24mg／L，比初始的27.2mg／L提高了18.53％。考察了发酵过程中溶氧对辅酶Q10产量的影响。将发酵培养过程分成两个阶段对溶氧条件进行考察，第一阶段获得以最大生长速率为目标的通气条件，第二阶段为在第一阶段培养结束后改变通气条件以进一步提高辅酶Q10产量。以正交试验确定第一阶段培养条件为：装液量25ml／250ml，转速210rpm和摇瓶形状为C3；以二次饱和D—最优设计试验得到第二阶段培养条件为：在第一阶段培养到104h时将转速调为180rpm。经过对溶氧条件的优化，发酵液中辅酶Q10产量达到38.22mg／L，比优化前提高了18.5％。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-11
第一章 文献综述  11-25
  1.1 引言  11
  1.2 辅酶Q_(10)的结构与性质  11-12
  1.3 辅酶Q_(10)的生理功能及其应用  12-14
    1.3.1 心肌保护  12
    1.3.2 治疗呼吸肌疲劳  12-13
    1.3.3 治疗冠心病  13
    1.3.4 治疗高血压  13
    1.3.5 治疗乙型脑炎  13
    1.3.6 治疗慢性肝炎  13-14
    1.3.7 其他应用  14
  1.4 辅酶Q_(10)的合成工艺  14-15
    1.4.1 化学合成法  14
    1.4.2 动植物组织提取法  14-15
    1.4.3 植物细胞培养法  15
    1.4.4 微生物发酵法  15
  1.5 微生物法制备辅酶Q_(10)的研究  15-24
    1.5.1 菌种及其诱变选育  16-20
    1.5.2 构建基因工程菌  20
    1.5.3 影响辅酶Q_(10)发酵积累的因素  20-24
  1.6 本文的研究思路  24-25
第二章 辅酶Q_(10)的测定和菌体中辅酶Q_(10)的提取  25-37
  2.1 前言  25-26
  2.2 实验材料与方法  26-27
    2.2.1 实验药品  26
    2.2.2 仪器设备  26
    2.2.3 菌体生物量的测定  26-27
  2.3 辅酶Q_(10)的检测及含量测定  27-30
    2.3.1 Craven试验显色法  27-28
    2.3.2 辅酶Q_(10)的HPLC测定  28-30
  2.4 发酵液中辅酶Q_(10)的批量提取方法  30-36
    2.4.1 实验方法  30-32
    2.4.2 结果与讨论  32-36
  2.5 本章小结  36-37
第三章 产辅酶Q_(10)的土壤根瘤杆菌菌株诱变育种  37-47
  3.1 前言  37
  3.2 实验材料与仪器设备  37-38
    3.2.1 菌种与试剂  37-38
    3.2.2 仪器设备  38
  3.3 实验方法  38-42
    3.3.1 培养基及培养条件  38
    3.3.2 菌种选育流程  38-39
    3.3.3 菌悬液制备  39
    3.3.4 筛选平板的选择与制备  39-40
    3.3.5 紫外诱变  40
    3.3.6 ~(60)Co_γ射线诱变  40-41
    3.3.7 复合诱变筛选  41
    3.3.8 32多孔板发酵培养  41-42
  3.4 结果与讨论  42-46
    3.4.1 出发菌株产辅酶Q_(10)能力  42
    3.4.2 多孔板培养结果  42-43
    3.4.3 诱变选育  43-45
    3.4.4 目的菌株遗传稳定性的测定  45-46
  3.5 本章小结  46-47
第四章 产辅酶Q_(10)的摇瓶发酵条件优化  47-58
  4.1 前言  47-48
  4.2 实验材料和仪器设备  48
    4.2.1 菌种和试剂  48
    4.2.2 仪器设备  48
  4.3 实验方法  48-49
    4.3.1 培养基  48
    4.3.2 培养方法  48
    4.3.3 分析方法  48
    4.3.4 氮源的选择  48-49
    4.3.5 碳源的选择  49
  4.4 结果与讨论  49-57
    4.4.1 氮源对菌体生长和辅酶Q_(10)产量的影响  49-51
    4.4.2 碳源对菌体生长和辅酶Q_(10)产量的影响  51-53
    4.4.3 Plackett-Burman设计筛选发酵关键因素  53-55
    4.4.4 均匀试验设计建模  55-57
  4.5 本章小结  57-58
第五章 溶氧对发酵产辅酶Q_(10)影响的初步研究  58-64
  5.1 前言  58-59
  5.2 实验材料和设备  59
    5.2.1 菌种  59
    5.2.2 仪器设备  59
  5.3 实验方法  59-60
    5.3.1 培养基及培养方法  59
    5.3.2 分析方法  59
    5.3.3 第一阶段的溶氧条件优化  59-60
    5.3.4 第二阶段的溶氧条件优化  60
  5.4 结果与讨论  60-63
    5.4.1 溶氧条件的第一阶段优化对生物量的影响  60-62
    5.4.2 溶氧条件的第二阶段优化对辅酶Q_(10)产量的影响  62-63
  5.5 本章小结  63-64
第六章 结论与建议  64-66
  6.1 结论  64-65
  6.2 建议  65-66
参考文献  66-74
致谢  74-75
攻读硕士期间论文发表情况  75

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 制药化学工业 > 生物制品药物的生产 > 酶及辅酶
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