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好食脉孢菌（N.sitophila）产锰过氧化物酶培养条件的优化、酶的纯化以及酶学性质的分析

作　者: 官敏
导　师: 刘大岭；姚冬生
学　校: 暨南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 好食脉孢菌锰过氧化物酶培养 DEAE RT-PCR
分类号: Q93-33
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

好食脉胞菌属于子囊菌的粪壳菌科，对木质素具有较高的降解能力。以前的学者对好食脉胞菌降解木质素的过程原理进行过详细研究，并对其产生的木质素过氧化物酶进行了分离纯化和性质研究，然而对好食脉孢菌产生的锰过氧化物酶尚未见详细报道。本研究对好食脉胞菌培养液中的三种主要木质素降解酶进行了活性分析，得出了它们的产酶曲线，曲线显示，三种酶中以LiP的活性最高，在培养的第6天达到6.45U／ml；其次为MnP，在第三天时活性为0.4U／ml；漆酶的活性很微弱。为了得到感兴趣的锰过氧化物酶，首先对好食脉胞菌的培养条件进行了优化探索，优化因素包括：碳源氮源的比例、碳源氮源的种类、培养的起始pH值、锰离子的影响等；并针对碳源、氮源、Mn²⁺三个因素设计了正交实验，考查了不同培养条件下的酶活。结果表明：（1）在低碳高氮的情况下有助于产酶；锰离子的添加对酶活没有影响，却能够诱导其他酚过氧化物酶的表达，这些结论与文献报道的一般情况有所不同。（2）在pH值为6.0，以2g／L木质纤维素和0.5g／L葡萄糖为碳源，以1g／L酒石酸铵和1g／L酵母抽提物为氮源时，氧气充足的条件下，菌体的生长效果最好，锰过氧化物酶的活性达到了0.8U／L，比优化前提高了2倍。为了对该菌产生的锰过氧化物酶进行深一步的研究，采用DEAE阴离子柱对发酵上清进行了初步的纯化工作。纯化结果表明pH 6.0的0.3M乙酸缓冲液的洗脱峰为活性峰；SDS-PAGE电泳结果显示该峰主要有四条蛋白带组成，其中分子量为65.9KD、52.6KD、38.5KD的三条带，经检测有锰过氧化物酶活性，并以分子量为38.5KD的蛋白质活性最高。进一步的实验发现，这三种蛋白质在无锰离子的情况下也可以氧化DMP底物，但仅显示原活性的60％；三种蛋白质单独存在时的酶活，均比混合存在时有明显提高。通过对纯化出的MnP3进行酶学性质分析，此酶的最适反应温度为60℃，最佳PH值为5.0，锰离子的浓度为2mM时反应的速度最大。Cu²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺对酶活都有促进作用，Zn²⁺、Ba²⁺、Mg²⁺对酶活有抑制作用。但是此酶的温度稳定性较差，随着温度的升高失活很明显。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
英文缩略词/中文对照表  12-13
第一章前言  13-23
  1.1 木质素的微生物降解  13-17
    1.1.1 木质素的概述  13-14
    1.1.2 木质素降解菌  14-16
    1.1.3 参与木质素降解的酶  16-17
  1.2 锰过氧化物酶的研究现状  17-20
    1.2.1 锰过氧化物酶的结构  17-18
    1.2.2 锰过氧化物酶的作用机制  18-19
    1.2.3 锰过氧化物酶的调节转录及表达  19-20
  1.3 应用前景  20-21
    1.3.1 造纸工业  20
    1.3.2 环境保护  20-21
    1.3.3 饲料工业  21
  1.4 研究的背景、思路及意义  21-23
第二章实验设备及材料  23-29
  2.1 主要仪器设备  23
  2.2 实验材料  23-29
    2.2.1 菌种  23
    2.2.2 培养基  23-25
    2.2.3 试剂  25-26
    2.2.4 溶液配制  26-28
    2.2.4 酶类  28
    2.2.5 试剂盒  28-29
第三章实验方法  29-40
  3.1 培养方法  29-30
    3.1.1 平板菌种扩大培养  29
    3.1.2 分解木质素过氧化物酶的定性检测(苯胺兰平板脱色法)  29
    3.1.3 不同的碳氮比例及锰离子浓度对培养的影响  29
    3.1.4 选用不同的碳源和氮源进行培养  29-30
    3.1.5 不同的培养起始PH对酶活的影响  30
  3.2 分析方法  30-31
    3.2.1 分解木质素过氧化物酶的活力测定方法  30
    3.2.2 培养基PH值的跟踪测定  30-31
    3.2.3 产酶曲线的测定  31
    3.2.4 培养上清中蛋白含量的测定  31
    3.2.5 菌体生物量测定  31
  3.3 锰过氧化物酶的纯化  31-33
    3.3.1 不同的沉淀法粗提发酵液中的MnP的效果的对比  31-32
    3.3.2 硫酸铵沉淀的透析  32
    3.3.3 DEAE阴离子交换柱层析分析目的蛋白  32
    3.3.4 SDS-PAGE电泳及蛋白的原位复性  32-33
  3.4 锰过氧化物酶性质的研究  33-34
    3.4.1 锰过氧化物酶分子量分析  33
    3.4.2 木质素过氧化物酶的最适反应温度和PH值  33
    3.4.3 酶的热稳定性和pH稳定性  33-34
    3.4.4 锰离子浓度对酶活性的影响  34
    3.4.5 金属离子对酶活性的影响  34
  3.5 木质素过氧化物酶基因的克隆  34-40
    3.5.1 总RNA的提取  34-35
    3.5.2 简并引物设计  35
    3.5.3 RT-PCR步骤  35-37
    3.5.4 切胶回收PCR产物  37
    3.5.5 TA克隆  37-39
    3.5.6 测序  39-40
第四章好食脉孢菌产锰过氧化物酶的优化培养结果与讨论  40-48
  4.1 好食脉孢菌产锰过氧化物酶的优化培养结果  40-46
    4.1.1 木质素过氧化物酶的定性检测  40-41
    4.1.2 好食脉孢菌的产酶曲线图  41
    4.1.3 好食脉孢菌发酵液的蛋白浓度曲线  41-42
    4.1.4 在培养过程中发酵上清的PH值的变化  42-43
    4.1.5 培养基的碳氮比优化  43-44
    4.1.6 碳源氮源的种类对产酶情况的影响  44-45
    4.1.7 不同的起始PH值对产酶情况的影响  45-46
    4.1.8 优化培养条件后的培养结果  46
  4.2 讨论  46-48
第五章锰过氧化物酶的纯化及酶学性质分析结果与讨论  48-56
  5.1 锰过氧化物酶的纯化结果  48-54
    5.1.1 锰过氧化物酶粗酶的沉淀  48
    5.1.2 DEAE柱层析结果  48-51
    5.1.3 锰过氧化物酶的最适反应pH值及pH稳定性  51-52
    5.1.4 MnP3的最适反应温度及温度稳定性  52-53
    5.1.5 Mn~(2+)对MnP3活力的影响  53-54
    5.1.6 金属离子对MnP3活力的影响  54
  5.2 讨论  54-56
第六章简并引物扩增MNP基因的保守区域结果与讨论  56-60
  6.1 总RNA提取的结果  56
  6.2 简并引物扩增保守序列  56-57
  6.3 单酶切鉴定  57
  6.4 RT-PCR产物的测序结果  57-58
  6.5 序列的BLAST结果  58
  6.6 讨论  58-60
小结与展望  60-61
参考文献  61-64
致谢  64

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