学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

鸡、猪、牛IgMμ链基因的体外表达及单克隆抗体的研制

作　者: 赵莉
导　师: 鲍恩东；步志高
学　校: 南京农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: IgMμ 单克隆抗体 早期诊断
分类号: S854.43
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 83次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


随着规模化养殖业的发展，畜禽传染病已成为对养殖业危害最严重的一类疾病，它不仅能造成大批畜禽死亡和畜产品的损失，影响人们生活和对外贸易，而且某些人畜共患的传染病还能给人们健康带来严重成胁。尤其是现代化的养殖业，畜禽饲养高度集中，调运移动频繁，更易受到传染病的侵袭。因此，迫切需要建立一种早期诊断方法进行快速诊断以控制病情，淘汰感染畜禽，减少损失，降低危害。 IgM是机体初次体液免疫反应中最早产生的免疫球蛋白，因此在抗感染免疫的早期起着十分重要的作用，可通过检测IgM抗体进行疫病的血清学早期诊断。本试验建立的抗IgMμ链单抗诊断方法对于研究这些疾病的免疫特性、诊断和防制技术均有重要意义。本研究以原核表达的IgMμ蛋白，采用长程免疫法免疫BALB／c小鼠，取四免后的小鼠脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞在PEG4000作用下进行细胞融合，融合率均达90％以上，将重组杆状病毒表达的鸡、猪、牛真核IgMμ蛋白同时作为包被抗原建立间接ELISA，用于检测筛选杂交瘤细胞上清中的抗体，三种ELISA检测均为阳性的细胞克隆经有限稀释法进行三次亚克隆，获得一株能稳定分泌抗鸡IgMμ单抗的杂交瘤细胞株，命名为1H2。将此株杂交瘤细胞经反复冻存、复苏及多次传代，仍能分泌高效价抗体，亚型鉴定为IgG1 κ型，腹水效价为1：1×106。间接ELISA和Western-blot检测显示，这株单抗具有良好的反应原性，能敏感、特异地检测出鸡、猪和牛血清中的IgM。 本研究所获得的抗IgMμ链单克隆抗体为鸡、猪和牛传染性疾病的早期快速诊断提供新且简便的途径，而且为进一步建立快速、敏感、特异的抗IgMμ链标记单抗诊断试剂盒奠定了基础。还可以用于检测组织部位中含有IgM的细胞以及对外周血中具有IgM表面抗原受体细胞进行定量，并且可以通过与B细胞膜表面抗原结合，从分子水平上研究B细胞抗原提呈特点，从而为显著降低疫苗接种剂量、提高机体免疫能力方面的探索提供新的实验手段。

全文目录


原创性声明  3
学位论文版权使用授权书  3-8
摘要  8-9
ABSTRACT  9-11
第一章 文献综述  11-20
  1 免疫球蛋白的概述  11-15
    1.1 免疫球蛋白的结构  11-14
      1.1.1 一级结构—两个基因,一条多肽  12-13
      1.1.2 二级结构—免疫球蛋白的折叠  13
      1.1.3 三级结构—免疫球蛋白的结构域  13
      1.1.4 四级结构—免疫球蛋白单体  13-14
      1.1.5 更高级的免疫球蛋白结构—多聚免疫球蛋白  14
    1.2 免疫球蛋白的功能  14-15
  2 IgM概述  15-17
    2.1 IgM的产生及其多样性产生的分子机制  15-16
    2.2 IgM的结构与功能  16-17
      2.2.1 IgM五聚体结构  16-17
      2.2.2 IgM的功能  17
  3 抗IgM单抗的研究进展  17-18
  4 本论文研究概述  18-20
    4.1 本论文的主要研究内容  18-19
    4.2 本论文研究意义及应用前景  19-20
第二章 cIgMμ、pIgMμ、bIgMμ基因的获取和序列测定  20-27
  1 材料和方法  20-24
    1.1 质粒与菌种  20
    1.2 扩增引物  20
    1.3 主要试剂  20
    1.4 外周血淋巴细胞的分离  20-21
    1.5 Trizol法从外周血淋巴细胞中提取总RNA  21
    1.6 oligo(dT)—纤维素层析法从总RNA中提取PolyA~+ mRNA  21
    1.7 反转录合成cDNA及PCR反应扩增目的IgMμ片段  21-22
    1.8 一步法制备DH5a大肠杆菌感受态细胞  22-23
    1.9 目的基因的序列测定  23-24
      1.9.1 处理载体pBluescriptⅡKS  23
      1.9.2 目的片断与质粒连接(连接体系5μL)  23
      1.9.3 连接产物转化  23
      1.9.4 重组pBlue-IgMμ质粒的筛选与鉴定  23-24
      1.9.5 重组质粒pBlue-IgMμ序列测定  24
  2 结果  24-26
    2.1 IgMμ RT-PCR扩增  24
    2.2 重组质粒pBlue-IgMμ的鉴定结果  24-25
    2.3 IgMμ片段碱基序列测定结果  25-26
  3 讨论  26-27
第三章 原核表达IgMμ_原蛋白及多抗制备  27-38
  1 材料和方法  27-32
    1.1 质粒与菌种  27
    1.2 扩增引物  27
    1.3 主要试剂  27
    1.4 pET-30a-IgMμ_原原核表达质粒的构建  27-29
      1.4.1 IgMμ_原基因片断的PCR扩增和测序  27-28
      1.4.2 pET-30a-IgMμ_原质粒的构建  28
      1.4.3 pET-30a-IgMμ_原质粒的鉴定  28-29
    1.5 原核表达IgMμ_原蛋白及SDS-PAGE  29-31
    1.6 原核表达IgMμ_原蛋白的纯化  31-32
      1.6.1 Ni-NTA柱的处理  31
      1.6.2 细菌裂解物的制备  31
      1.6.3 IgMμ_原蛋白的纯化  31-32
      1.6.4 原核表达IgMμ_原蛋白的透析  32
    1.7 抗IgMμ_原多克隆抗血清的制备  32
  2 结果  32-37
    2.1 PCR扩增IgMμ_原原核表达片断  32
    2.2 pET-30a-IgMμ_原的酶切鉴定结果  32-34
    2.3 原核表达IgMμ_原蛋白的鉴定  34-37
    2.4 间接ELISA测定兔抗IgMμ_原蛋白高免血清的抗体效价  37
  3 讨论  37-38
第四章 重组杆状病毒表达IgMμ_真蛋白及其抗原性研究  38-53
  1 材料和方法  39-46
    1.1 质粒与菌种  39
    1.2 扩增引物  39-40
    1.3 主要试制  40
    1.4 重组转移载体pFastBac~(TM)1-IgMμ_真的构建  40-42
      1.4.1 IgMμ_真基因片断的PCR扩增和测序  40-41
      1.4.2 pFastBac~(TM)1-IgMμ_真转移载体的构建  41
      1.4.3 pFastBac~(TM)1-IgMμ_真转移载体的提取和鉴定  41-42
    1.5 同源重组构建rBacmid-IgMμ_真及其PCR鉴定  42-44
      1.5.1 重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-IgMμ_真的构建  42
      1.5.2 重组杆状病毒穿梭质粒DNA的提取  42-43
      1.5.3 重组穿梭质粒rBacmid-IgMμ_真的PCR鉴定  43-44
    1.6 重组杆状病毒rBac-IgMμ_真及PCR鉴定  44-45
      1.6.1 细胞准备  44
      1.6.2 转染混合物的准备  44
      1.6.3 转染  44
      1.6.4 重组杆状病毒DNA的提取及鉴定  44-45
      1.6.5 重组杆状病毒的毒力扩增  45
    1.7 间接免疫荧光检测重组杆状病毒表达蛋白  45
    1.8 间接ELISA检测重组杆状病毒表达蛋白  45-46
    1.9 重组杆状病毒表达蛋白的Western Blot检测  46
      1.9.1 重组杆状病毒表达蛋白的SDS-PAGE电泳  46
      1.9.2 电转移  46
      1.9.3 Western Blot  46
  2 结果  46-51
    2.1 PCR扩增IgMμ_真片断  46-47
    2.2 IgMμ_真序列测定  47
    2.3 重组质粒pFastBac~(TM)1-IgMμ_真的鉴定  47-48
    2.4 重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-IgMμ_真的鉴定  48
    2.5 重组杆状病毒的PCR鉴定  48-49
    2.6 间接免疫荧光(IFA)分析  49-50
    2.7 重组杆状病毒表达蛋白的检测  50-51
    2.8 重组杆状病毒表达蛋白的Western Blot检测  51
  3 讨论  51-53
第五章 抗IgMμ_原单克隆抗体的制备  53-64
  1 材料和方法  53-58
    1.1 免疫原  53
    1.2 细胞系与实验动物  53
    1.3 主要试剂及培养基  53
    1.4 动物免疫  53
    1.5 抗原包被最佳浓度与对照血清最佳稀释度的确定  53-54
    1.6 骨髓瘤细胞的复苏、培养与制备  54
    1.7 饲养细胞制备  54
    1.8 脾细胞的制备  54-55
    1.9 细胞融合  55
    1.10 阳性杂交瘤细胞的筛选  55
    1.11 杂交瘤细胞的克隆化、冻存和复苏  55-56
    1.12 单克隆抗体腹水的制备  56
    1.13 杂交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定  56-57
      1.13.1 腹水效价的测定  56
      1.13.2 抗体亚类的测定  56-57
    1.14 抗cIgMμ_原单克隆抗体与猪、牛及鸡血清中IgM的免疫反应性  57-58
      1.14.1 血清中IgM的粗提  57
      1.14.2 Toyopearl HW-55柱层析纯化IgM  57
      1.14.3 间接ELISA检测单抗的免疫反应性  57-58
  2 结果  58-62
    2.1 间接ELISA检测免疫小鼠的抗体水平  58
    2.2 IgMμ_真抗原包被最佳浓度与阳性对照血清最佳稀释度的确定  58-59
    2.3 细胞融合率与阳性率的计算  59
    2.4 单克隆抗体的筛选与单克隆杂交瘤细胞株的建立  59-60
    2.5 抗IgMμ_原单克隆抗体细胞株的建立  60
    2.6 单抗腹水效价的测定和亚型鉴定  60
    2.7 抗IgMμ_原单克隆抗体与猪、牛及鸡血清中IgM的反应性  60-62
  3 讨论  62-64
全文总结  64-65
参考文献  65-72
附录  72-77
致谢  77

相似论文

  1. 抗吡虫啉—甲基对硫磷双特异性单克隆抗体的研究,S482.2
  2. 心肌型脂肪酸结合蛋白在急性心肌梗死早期诊断中的价值,R542.22
  3. 甲型流感病毒M2蛋白的表达、纯化及其免疫原性的研究,R392
  4. STLV-1病毒间接ELISA方法建立及杂交瘤细胞株的筛选,R373
  5. 鸭源鸡杆菌抗体消长规律研究及抗脂多糖单抗杂交瘤细胞株的建立,S858.32
  6. 稳定分泌抗羊种布鲁菌脂多糖单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立,R392
  7. 传染性法氏囊病病毒VP2基因的表达与单克隆抗体的制备,S852.65
  8. 猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定,S852.65
  9. 抗噻菌灵单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立,S482.2
  10. 氯噻啉酶联免疫吸附分析方法研究,S482.3
  11. 华东地区鸭圆环病毒感染流行病学调查及其单克隆抗体的制备,S858.32
  12. 猪TNF-α单克隆抗体制备与PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞TNF-α变化规律研究,S858.28
  13. H9亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及其AC-ELISA检测方法的建立,S855.3
  14. 日本血吸虫重组蛋白rSjGST的表达纯化及单克隆抗体的制备和特性鉴定,R392
  15. 三聚氰胺单克隆抗体制备及间接竞争ELISA方法的初步建立,S859.84
  16. 子宫肉瘤14例临床分析,R737.33
  17. 人乳头瘤病毒16型E7蛋白单克隆抗体的研制,R737.33
  18. 1.tmTNF-α通过TNFR2诱导凋亡的信号途径 2.抗体的制备及鉴定,R392
  19. SIgA分泌片的原核表达及抗分泌片单克隆抗体的制备,S852.4
  20. AGR2单克隆抗体18A4抑制乳腺癌细胞的生长和迁移,R737.9
  21. 闭孔疝的诊断及治疗,R656.2

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医临床医学 > 兽医诊断学 > 实验室诊断法
© 2012 www.xueweilunwen.com