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人ITSN2基因新剪接异构体的克隆和鉴定

作　者: 刘倩
导　师: 张健；向双林
学　校: 湖南师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: ITSN2基因选择性剪切剪切异构体反转录PCR
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

Intersectin家族成员ITSN1和ITSN2,都是有广泛表达的蛋白。它们都有2个EH结构域、一个CC结构域和5个连续的SH3结构域,通过选择性剪接具有2个主要的转录本。一个短的转录本S和一个在C端依次增加了编码DH.PH和C2结构域的长转录本L。相对于ITSN1, ITSN2在组织表达中更有普遍性。研究表明ITSN主要在网格蛋白介导的内吞过程中起到支架蛋白的作用。TNFAIP1是一个受肿瘤坏死因子α(TNFFα)诱导表达的即早基因,为了研究TNFAIP1的相互作用蛋白,我们以TNFAIP1为诱饵蛋白,使用酵母双杂交技术筛选人的胚胎脑库,结果筛选出了ITSN2基因的一段,主要包含EH2和CC两个结构域。为了进一步研究它们之间的相互作用,我们首先克隆了ITSN2。先克隆前、中、后三部分再连接起来得到ITSN2全长,测序结果显示相对于ITSN2-L缺失了了17号外显子和36号外显子的一部分。我们将这一新剪切体命名为ITSN2-M。分析显示ITSN2-M的前期读码结构没有改变,但在36号缺失后产生了一个终止密码子。因为17号外显子的缺失,位于中间的CC结构域被破坏；而36号外显子缺失导致翻译终止,影响了PH和C2结构域。说明这种不同于ITSN2-L的转录本,具有不同的结构域,而与蛋白相互作用的结构域的改变可能使ITSN2-M结合不同的蛋白,从而行使不同的功能。我们用实验确定了在ITSN2-M中,17号外显子和36号外显子是同时缺失的。分别提取HeLa、293FT、MCF7和Panc1细胞的RNA反转录成cDNA,以此为模板进行反转录PCR检测外显子缺失情况,都有17号和36号外显子缺失。我们用ITSN2的EH和CC结构域段作为抗原,注射兔子得到兔子抗EC的抗体。分别用细胞免疫荧光和Western Bolt检测了抗体的特异性。用EC抗体在293FT、HeLa、SK-SN-SH细胞和人正常胚胎的脑、脑干组织中检测ITSN2蛋白的表达。其中ITSN2-M在正常脑和脑干中表达很高,但是在神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH中表达量很低。这可能说明ITSN2-M在神经细胞中具有重要的生理学作用和功能。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-8
英文缩写表  8-11
前言  11-20
  1 ITSN家族简介  11-13
    1.1 ITSN家族成员介绍  11-12
    1.2 ITSN蛋白功能介绍  12-13
  2 选择性剪切  13-18
    2.1 选择性剪切介绍  13-16
    2.2 ITSN剪切体介绍  16-18
  3 研究背景介绍  18-20
第一部分材料与方法  20-40
  1 实验材料  20-25
    1.1 菌种和细胞株  20
    1.2 载体和工具酶  20
    1.3 抗体  20-21
    1.4 试剂盒  21
    1.5 其它试剂  21
    1.6 所需溶液  21-24
    1.7 主要仪器设备  24-25
  2 实验方法  25-40
    2.1 克隆ITSN2基因  25-28
    2.2 序列分析  28
    2.3 RT-PCR验证缺失序列  28-29
    2.4 RT-PCR检测两部分是否同时缺失  29-30
    2.5 RT-PCR检测细胞系中ITSN2外显子的缺失  30-33
    2.6 抗体制备  33-36
    2.7 抗体特异性检测  36-38
    2.8 Western blot检测ITSN2蛋白表达  38-40
第三部分结果分析  40-46
  3.1 发现新的ITSN2剪接体ITSN2-M  40
  3.2 序列分析  40-41
  3.3 验证ITSN2-M缺失部位  41-42
  3.4 反转录PCR检测细胞系中ITSN2外显子缺失  42-43
  3.5 抗体制备和特异性检测  43-45
  3.6 ITSN2蛋白的检测  45-46
第四部分讨论  46-51
参考文献  51-59
附录  59-60
致谢  60-61

人ITSN2基因新剪接异构体的克隆和鉴定

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