学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示
H1N1亚型SIV河南株的分离鉴定、HA基因的克隆和序列分析及荧光定量PCR诊断方法的建立
作 者: 段廷云
导 师: 崔保安
学 校: 河南农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词: 猪流感病毒 HINI亚型 糖基化位点 变异 探针 实时荧光定量PCR
分类号: S854.43
类 型: 硕士论文
年 份: 2006年
下 载: 189次
引 用: 0次
阅 读: 论文下载
内容摘要
猪流感是世界范围内常见的呼吸系统传染病之一,早在上世纪二十年代就开始在美洲流行。常与其它病原共同感染而加重了对世界各国的养殖业的危害。此外,由于猪被称为是流感病毒的组合器,猪流感病毒因而在公共卫生方面也有着十分重要的意义。流感病毒亚型众多和容易变异的特点给该病的诊断和防治带来了诸多挑战。H1N1是猪流感最常见的亚型之一,在我国多个省份都有过报道。为了研究猪流感病毒的分子流行病学变化规律,找到准确、敏感的诊断方法,为猪流感的防治奠定分子生物学角度的基础和依据,本试验从河南本地猪场分离了H1N1亚型猪流感病毒,并建立了能够对病料进行定量检测的实时荧光定量PCR诊断方法。 病毒被命名为A/Swine/Henan/407/2005(H1N1)(简称为SHN407),为热不稳定型,对酸敏感,能导致小白鼠发病、死亡。从存活的小白鼠血清中可以检测到特异性抗体,EID50,ELD50分别为10-6.5和10-1.75。从GenBank上下载了世界各地多个典型H1N1亚型毒株HA基因,在编码区以外相对保守区设计了一对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增出SHN407株的HA基因,然后将其克隆到pGEM-T载体上,转化到JM109大肠杆菌中,经蓝白斑筛选后将阳性菌株的重组质粒测序。序列分析发现该毒株的HA基因全长1701bp。HA全基因共编码566个氨基酸,其中HA1包含330个、HA2包含221个。共有7个糖基化位点,其中HA1上有5个、HA2上有2个。裂解位点附近没有碱性氨基酸存在,不具有高致病性毒株的特征。HA基因的同源性及系统发育树显示,该毒株与香港、中国内地、北美的古典H1N1亚型分离株的亲缘关系较远,而与欧洲各国流行株的亲缘关系较近,为典型的类禽H1N1亚型猪流感病毒。 从GenBank上下载了来自世界各地多个典型毒株的NP基因,利用DNAstar软件进行分析比较,在大约1300—1500bp之间发现了一个相对保守区。利用Premier express引物设计软件找到了一对引物和相应的探针序列。在探针的5’端以FAM标记;3’TAMRA标记。利用上述引物,通过RT-PCR方法扩增出SHN407株的部分NP基因,然后将其克隆到pGEM-T载体上,转化到JM109大肠杆菌中,经蓝白斑筛选后将阳性菌株测序,测序结果证实扩增的序列完全正确。将从细菌中提取的重组阳性质粒10倍梯度稀释,作为阳性定量标准模板,用于标准曲线的建立和样品的检测。本试验经过对探针浓度、引物浓度、镁离子浓度和退火温度的一系列优化比较,建立了最佳的反应体系和扩增程序,标准曲线上各点均匀一致。该方法对H3N2、H9N2等流感病毒亚型以及猪体内常见的多种病毒对比试验均显示阴性。与普通PCR方法相比,荧光定量PCR不仅解决了不能绝对定量的难题,在定性检测上也更为敏感。H1N1亚型荧光定量PCR诊断方法的建立为猪流感的病理研究创造了有利条件。
|
全文目录
摘要 6-7 文献综述 7-17 引言 17-19 实验一 H1N1亚型猪流感病毒的分离与鉴定 19-27 1.材料与方法 19-22 2.结果 22-24 3.讨论 24-26 4.结论 26-27 实验二 HH1N1亚型猪流感病毒HA基因的克隆和序列分析 27-46 1.材料与方法 27-33 2.结果 33-43 3.讨论 43-45 4.结论 45-46 实验三 H1N1亚型猪流感荧光定量PCR诊断方法的建立 46-57 1.材料与方法 46-51 2.结果 51-56 3.讨论 56 4.结论 56-57 参考文献 57-64 Abstract 64-65
|
相似论文
- 光探针测量系统中瞄准信号的检测与处理的研究,TH74
- 草菇采后生理生化及保鲜方法的研究,S646.13
- 中医药干预慢性心力衰竭患者心率变异性的研究,R259
- HCV准种变异特性及其免疫逃逸机制初步研究,R392.1
- 污染源周边农田重金属污染风险评价与控制技术试验,X820.4
- 基于GIS的植烟土壤养分分区及推荐施肥研究,S158
- 弯孢属种分子鉴定体系的建立及其在疑难种上的应用,Q949.32
- 单细胞中光敏化单态氧的间接成像,Q2-3
- 微生物有机肥防治土传棉花黄萎病的效果及对根际微生物影响,S144.1
- 新疆紫草细胞的稀土生物学效应及遗传转化,S567.239
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒遗传变异分析及猪α干扰素的真核表达,S858.28
- 用于铜、锌或铁离子检测的新型荧光探针分子合成及性能研究,O621.3
- 侵蚀红壤小流域土壤养分空间变异与肥力质量评价,S158
- 滩涂土壤养分与沉积物重金属空间变异及评价研究,S158
- GIS和地统计学应用于泸州植烟土壤养分空间变异及分区管理技术研究,S158
- 大白菜霜霉菌诱导抑制性消减cDNA文库的构建及防御相关基因的表达分析,S436.341
- 棉铃虫与烟夜蛾寄主选择机制的比较研究,S435.622.3
- 小麦籽粒硬度相关基因分子鉴定及PINA蛋白缺失分子机制研究,S512.1
- 黄淮和南方地区大豆育成品种籽粒性状遗传构成的分子标记解析及等位变异优选,S565.1
- 我国栽培大豆品种的遗传多样性分析与青籽粒性状QTL的关联定位,S565.1
- 萝卜镉胁迫响应相关基因克隆及其表达分析,S631.1
中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 兽医临床医学 > 兽医诊断学 > 实验室诊断法
© 2012 www.xueweilunwen.com
|